腦膠質(zhì)瘤中IDH1--R132H型突變對NK細胞抗腫瘤作用影響的研究.pdf

1、目的：
　　大腦和脊髓膠質(zhì)細胞產(chǎn)生癌變所引起的腦膠質(zhì)瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，與人體其他系統(tǒng)腫瘤相比預(yù)后較差，且只有最長不超過2年的中位生存期，并且其發(fā)病率在近幾年來有逐漸上升的趨勢。雖然手術(shù)是目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要手段，但是腫瘤組織卻無法完全的切除，而放化療對于膠質(zhì)瘤的治療具有一定的療效，但也存在一定的副作用，限制了治療效果，所以膠質(zhì)瘤仍然具有很高的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，病人預(yù)后很差。因此，對于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機制研

2、究，以及尋找其治療的新靶點和新策略至關(guān)重要。
　　自2008年，Parsons等使用高通量測序技術(shù)最先檢測到了腦膠質(zhì)瘤中存在IDH1（異檸檬酸脫氫酶基因1）突變以來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)這種突變與膠質(zhì)瘤的診斷與治療以及患者預(yù)后的評價都存在較高的相關(guān)性。因此對IDH1突變的研究已成為膠質(zhì)瘤中的研究熱點之一。
　　目前，不少研究已經(jīng)證實腦膠質(zhì)瘤患者中IDH1基因突變，尤其是R132H型突變，能夠明顯改善患者預(yù)后。然而，這種現(xiàn)象的分子機

3、制還不是很清楚。已有報道顯示IDH1突變主要是通過代謝過程來影響患者的預(yù)后，而IDH1突變對膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的影響的研究較少。
　　腫瘤微環(huán)境主要是指在腫瘤發(fā)生和進展過程中，腫瘤細胞依存的復(fù)雜環(huán)境，包括腫瘤細胞及多種細胞因子、趨化因子、基質(zhì)細胞等。腫瘤微環(huán)境中，特別是腫瘤的免疫微環(huán)境，同時含有抑制腫瘤以及促進腫瘤的免疫細胞和分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后診斷的過程中起到重要的作用。
　　本課題的主要任務(wù)是研究IDH1

4、突變是如何影響膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境，進而改善患者的預(yù)后，最終為IDH1-R132H突變患者的腫瘤免疫治療提供潛在的治療靶點。
　　方法：
　　利用TCGA、CGGA兩個數(shù)據(jù)庫分析IDH1野生型和IDH1-R132H突變型患者預(yù)后的差異;利用數(shù)據(jù)庫篩選IDH1野生型與IDH1-R132H突變患者表達有差異的免疫細胞以及細胞因子，收集臨床組織標本進行驗證;利用Kaplan-Meier生存分析方法分析腦膠質(zhì)瘤患者CD56的表達與生存預(yù)

5、后的關(guān)系;體外構(gòu)建IDH1-WT和IDH1-R132H雜合型突變細胞系，并通過Western-Blot以及質(zhì)譜驗證;體外培養(yǎng)擴增健康人血來源的NK細胞分別與野生型和突變型細胞系培養(yǎng)上清共孵育，檢測兩組NK細胞凋亡的差異;Transwell實驗驗證兩株細胞系招募NK細胞的差異;臨床組織標本篩選以及數(shù)據(jù)庫驗證招募NK細胞有關(guān)的趨化因子，并在細胞系水平上使用熒光定量PCR法以及Western-Blot進行檢測;通過流式檢測技術(shù)驗證趨化因子CX

6、3CL1受體CX3CR1在野生型和突變型膠質(zhì)瘤組織中表達差異;通過Western-Blot技術(shù)等分析膠質(zhì)瘤IDH1-R132H突變上調(diào)趨化因子CX3CL1的分子機制;數(shù)據(jù)庫和臨床標本分析全部腦膠質(zhì)瘤患者以及其中IDH1-R132H突變的患者CX3CL1與CD56表達的相關(guān)性，以及CX3CL1表達的高低與患者預(yù)后的關(guān)系;最后使用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，敲除腦膠質(zhì)瘤U87細胞系IDH1基因，并構(gòu)建敲除本底IDH1表達的I

7、DH1-R132H純合突變型細胞系。
　　結(jié)果：
　　1、TCGA、CGGA兩個數(shù)據(jù)庫證實了IDH1-R132H突變能夠改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。
　　2、構(gòu)建了過表達IDH1野生型和IDH1-R132H突變型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染U87細胞系，成功構(gòu)建了過表達IDH1野生型和IDH1-R132H雜合突變型細胞系。
　　3、數(shù)據(jù)庫分析、組織標本以及體外細胞系Transwell實驗得出結(jié)論:膠質(zhì)瘤IDH1-R132H突變能夠?qū)е履[

8、瘤局部NK細胞的累積，進而改善患者的預(yù)后。
　　4、數(shù)據(jù)庫分析、組織標本以及細胞系水平上驗證IDH1-R132H突變是通過上調(diào)趨化因子CX3CL1，從而促進NK細胞向腫瘤組織趨化。
　　5、IDH1-R132H突變代謝物2-HG能夠促進磷酸化NF-κB的表達，進而上調(diào)趨化因子CX3CL1表達。
　　6、數(shù)據(jù)庫以及臨床標本驗證出在全部膠質(zhì)瘤患者和IDH1-R132H突變患者中CX3CL1與CD56表達具有較高的相關(guān)性。<

9、br>　　7、利用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)成功獲得了IDH1基因敲除的腦膠質(zhì)瘤U87細胞系，并構(gòu)建了敲除本底IDH1表達的IDH1-R132H純合突變型細胞系，為后續(xù)進一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：
　　腦膠質(zhì)瘤IDH1-R132H突變能夠通過調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境進而改善患者預(yù)后。IDH1-R132H突變代謝物2-HG促進p-NF-κB的表達，使趨化因子CX3CL1的表達上調(diào)，從而招募更多的NK細胞到腫