抑制小膠質(zhì)細胞MT1-MMP表達對膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 長期以來中樞神經(jīng)系統(tǒng)被認為是一個免疫特免器官，缺少外周免疫細胞、與免疫相關(guān)的部分細胞因子及血漿蛋白。然而1964年Scheinberg等的腦腫瘤移植實驗中證實，移植部位周圍有輕度的淋巴細胞浸潤及小膠質(zhì)細胞增生，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)并非絕對免疫特免器官。小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫監(jiān)督中具有關(guān)鍵作用，但近年來隨著分子生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞還與膠質(zhì)瘤的發(fā)展密切相關(guān)。
　　 腦膠質(zhì)瘤是人神經(jīng)系統(tǒng)

2、中發(fā)病率最高、惡性程度最高、預后最差的一種惡性腫瘤。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，雖然目前膠質(zhì)瘤的診斷和治療方法有了較大的進步，但療效尚不令人滿意，大部分惡性膠質(zhì)瘤病人生存期在一年以內(nèi)。早在1925年，Wilder通過對腦膠質(zhì)瘤組織銀染色觀察，第一次詳細地描述了膠質(zhì)瘤組織中小膠質(zhì)細胞的存在。腦膠質(zhì)瘤被證明具有免疫原性，但奇怪的是在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中并未發(fā)現(xiàn)機體對腫瘤產(chǎn)生明顯的免疫反應。對手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤標本進行免疫組化的實驗中發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤組

3、織中有大量的小膠質(zhì)細胞及巨噬細胞集聚現(xiàn)象，同時還伴隨少量的淋巴細胞浸潤。對于腦膠質(zhì)瘤組織中出現(xiàn)高水平的小膠質(zhì)細胞浸潤，目前傾向于認為是由于膠質(zhì)瘤細胞在腫瘤的生長過程中向周圍細胞微環(huán)境分泌釋放趨化分子及生長因子等物質(zhì)所致。
　　 研究表明，膠質(zhì)瘤病灶中的小膠質(zhì)細胞對膠質(zhì)瘤細胞及細胞碎片幾乎無吞噬現(xiàn)象出現(xiàn)。膠質(zhì)瘤相關(guān)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞(GIMs)盡管仍能表達Toll樣受體(TLR)，且TLR及其配體的相互作用仍存在，但是不能引起G

4、IMs激活而增強細胞身吞噬功能;另外，由于缺少必要的刺激分子CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和CD40的表達，GIMs不能提供充足的刺激以激活T淋巴細胞。在對從老鼠分離培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤相關(guān)小膠質(zhì)細胞在受到刺激信號后并不上調(diào)第二型主要組織相容性復合體(MHC-Ⅱ)的表達，以至于小膠質(zhì)細胞所表達的主要組織相容性復合體(MHC)不足以進行抗原呈遞激活T淋巴細胞，而在無膠質(zhì)瘤細胞的情況下小膠質(zhì)細胞可明顯的增強MHC

5、-Ⅱ及B7的表達。膠質(zhì)瘤細胞能夠下調(diào)脂多糖(LPS)誘導的活化小膠質(zhì)細胞分泌釋放促炎癥因子TNF-α能力。另外，膠質(zhì)瘤細胞促使活化小膠質(zhì)細胞分泌釋放白介素-10(IL-10)，后者抑制小膠質(zhì)細胞由IFN-γ誘導的MHC分子表達引起抗原呈遞功能下降，直接導致小膠質(zhì)細胞難以激活T淋巴細胞。以上資料表明，由于受到膠質(zhì)瘤細胞對小膠質(zhì)細胞的吞噬、抗原呈遞及分泌釋放促炎癥因子等功能的抑制，小膠質(zhì)細胞在膠質(zhì)瘤組織中不能啟動針對癌細胞的、有效的固有性及

6、適應性免疫反應。
　　 近期研究表明，小膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤微環(huán)境免疫抑制及促膠質(zhì)瘤增殖、浸潤有密切關(guān)系。金屬蛋白酶(MMPs)所誘導的基質(zhì)降解機制在膠質(zhì)瘤侵襲和遷移過程中具有關(guān)鍵性的作用。MMP-2和MMP-9被認為與腫瘤的侵襲與遷移最為密切相關(guān)，而小膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞本身均是MMPs的重要細胞來源。這些MMPs被分泌釋放入腫瘤微環(huán)境，參與降解膠質(zhì)瘤細胞外基質(zhì)，并最終為膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲和遷移過程“鋪路”。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤能夠

7、引起小膠質(zhì)細胞膜上MT1-MMP表達升高，而小膠質(zhì)細胞MT1-MMP高表達又反過來促進膠質(zhì)瘤所分泌釋放的pro-MMP-2激活，大量活性MMP-2被分泌釋放入膠質(zhì)瘤微環(huán)境中，最終促進膠質(zhì)瘤侵襲和遷移。因此，如果能夠抑制小膠質(zhì)細胞中促膠質(zhì)瘤相關(guān)MMPs的表達，則有望降低膠質(zhì)瘤侵襲和遷移的能力。
　　 阿托伐他汀是3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，一直以來作為治療心血管疾病藥物被廣泛應用于降低血液中膽固醇含

8、量，但最近發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀具有抗腫瘤作用。在內(nèi)皮細胞及多種腫瘤中觀察到他汀類藥物對MMP-2、MMP-9和MT1-MMP的抑制作用。因此，我們選擇阿托伐他汀作為干預因素探討其是否能夠影響膠質(zhì)瘤細胞和小膠質(zhì)細胞之間MMPs表達及其對膠質(zhì)瘤侵襲和遷移影響。
　　 方法：
　　 1、CCK-8法定量檢測梯度濃度阿托伐他汀對原代人小膠質(zhì)細胞和U87膠質(zhì)瘤細胞活性影響。
　　 2、細胞遷移實驗和腫瘤侵襲實驗:通過膠質(zhì)瘤條件培

9、養(yǎng)基(GCM)孵化小膠質(zhì)細胞，制備小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基(MCM)。應用Transwell細胞遷移實驗和腫瘤侵襲實驗，檢測MCM干預下U87侵襲和遷移能力，同時使用阿托伐他汀干預GCM孵化小膠質(zhì)細胞制備MCM過程，檢測U87侵襲和遷移能力改變。
　　 3、明膠酶譜法檢測阿托伐他汀干預下U87膠質(zhì)瘤細胞MMP-2和MMP-9表達，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預下小膠質(zhì)細胞MMP-2和MMP-9表達。
　　 4、Western

10、Blotting檢測阿托伐他汀干預下U87膠質(zhì)瘤細胞MT1-MMP、P-p38 MAPK、P-ERK和P-JNK表達，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預下小膠質(zhì)細胞MT1-MMP、P-p38 MAPK、P-ERK和P-JNK表達。
　　 5、QPCR檢測阿托伐他汀干預下U87膠質(zhì)瘤細胞MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相關(guān)基因表達，及阿托伐他汀與GCM聯(lián)合干預下小膠質(zhì)細胞MMP-2、MMP-9和MT1-MMP相關(guān)基因表達。

11、　　 結(jié)果：
　　 1、10-4 mol/L阿托伐他汀作用于細胞24h，U87膠質(zhì)瘤細胞與和小膠質(zhì)細胞細胞活力均明顯降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。10-10mol/L阿托伐他汀顯著增強小膠質(zhì)細胞活力，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。10-9～10-5 mol/L各組U87膠質(zhì)瘤細胞與小膠質(zhì)細胞活力與對照組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。根據(jù)結(jié)果，我們選擇藥物安全濃度內(nèi)

12、最大藥物濃度10-5 mol/L作為后續(xù)實驗藥物濃度。
　　 2、細胞遷移實驗:10-5 mol/L阿托伐他汀干預24h，每400倍鏡下U87膠質(zhì)瘤細胞遷移平均數(shù)為55.7±3.0，與對照組U87膠質(zhì)瘤細胞遷移平均數(shù)63.7±3.3相比減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 MCM干預24h，U87膠質(zhì)瘤細胞遷移平均數(shù)為89.4±3.5，與對照組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。阿托伐他汀MCM干預24h，U8

13、7膠質(zhì)瘤細胞遷移平均數(shù)為56.3±3.2，與MCM干預組比較顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 腫瘤侵襲實驗:MCM干預24h，每400倍鏡下U87細胞侵襲平均數(shù)為28.2±2.8，與對照組U87細胞侵襲平均數(shù)13.2±1.9相比顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。阿托伐他汀MCM干預24h，U87細胞侵襲平均數(shù)為11.3±1.0，與MCM干預組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。10-

14、5mol/L阿托伐他汀干預24h，U87細胞侵襲平均數(shù)為10.2±3.1，與對照組相比略微減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3、將樣品濃縮經(jīng)明膠酶譜法檢測U87細胞和小膠質(zhì)細胞上清液中MMP-2和MMP-9表達。GCM干預24h，小膠質(zhì)細胞上清液中MMP-2表達顯著升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀+GCM聯(lián)合干預24h，小膠質(zhì)細胞上清液中MMP-2表達較GCM干

15、預組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀干預24h，小膠質(zhì)細胞上清液中MMP-2表達與對照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。10-5 mol/L阿托伐他汀干預24h，小膠質(zhì)細胞上清液中MMP-9表達降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。另外，U87細胞在阿托伐他汀中孵化24h，MMP-2表達降低。
　　 4、收集經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化的小膠質(zhì)細

16、胞和U87細胞，檢測各組細胞中MT1-MMP、P-p38、P-JNK和P-ERK的蛋白表達。結(jié)果顯示，GCM孵化小膠質(zhì)細胞24h，小膠質(zhì)細胞MT1-MMP表達與對照組相比顯著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小膠質(zhì)細胞24h，小膠質(zhì)細胞MT1-MMP表達較GCM干預組顯著降低。10-5mol/L阿托伐他汀干預U87細胞24h，U87細胞MTI-MMP表達與對照組相比輕微降低。小膠質(zhì)細胞經(jīng)GCM孵化12h和24h，P-p38表

17、達均較對照組顯著升高。10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化小膠質(zhì)細胞12h和24h，P-p38表達分別與GCM干預12h和24h相比顯著降低，但P-JNK和P-ERK表達分別與GCM干預12h和24h相比無明顯變化。U87細胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀干預24h，U87細胞P-JNK表達較對照組降低，P-ERK和P-p38表達無明顯差異。
　　 5、收集經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h的小膠質(zhì)細胞和U87細胞，檢

18、測各組細胞中MMP-2、MMP-9和MTI-MMP相關(guān)基因表達。結(jié)果顯示，小膠質(zhì)細胞經(jīng)GCM、10-5mol/L阿托伐他汀+GCM或10-5mol/L阿托伐他汀干預24h，MMP-2基因表達與對照組無明顯變化（P＞0.05），各組間均無明顯差異(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。小膠質(zhì)細胞經(jīng)GCM孵化24h，MTl-MMP基因表達較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。小膠質(zhì)細胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀+GCM孵化2

19、4h，MTI-MMP基因表達與GCM干預組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。U87細胞經(jīng)10-5mol/L阿托伐他汀孵化24h，U87細胞的MMP-2、MMP-9和MTI-MMP基因表達均較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過模擬膠質(zhì)瘤與小膠質(zhì)細胞間相互作用，證實了阿托伐他汀通過抑制小膠質(zhì)細胞的促腫瘤作用降低膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移能力，并且這一作用可能是通過抑