慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)Omp25基因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的Omp25基因轉(zhuǎn)染小鼠小膠質(zhì)(BV2)細(xì)胞，觀察Omp25蛋白的表達(dá)情況，探索布魯氏桿菌毒力因子Omp25過(guò)表達(dá)對(duì)BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)作用，為進(jìn)一步揭示0mp25基因在布魯氏桿菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的分子致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：選取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為三組：感染Omp25重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體（LV-Omp25-GFP組）作為實(shí)驗(yàn)組，感染慢病毒陰性載體組（LV-GFP組）作為陰性對(duì)照組，

2、另設(shè)空白對(duì)照組。感染72h后：在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，判斷慢病毒轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)流式細(xì)胞儀熒光分選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)的BV2細(xì)胞，用于以下實(shí)驗(yàn)：
　?、匐娮油干潆婄R：觀察慢病毒感染組及空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)胞在感染前后超微結(jié)構(gòu)的變化。
　?、诜謩e提取各組RNA、DNA，半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中O

3、mp25基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平驗(yàn)證Omp25表達(dá)成功與否。
　?、鄯謩e收集LV-Omp25-GFP組、LV-GFP組、空白對(duì)照組細(xì)胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6、NO的分泌。
　?、躈F-κB信號(hào)通路特異性抑制劑BAY11-70825um預(yù)處理BV2細(xì)胞60min后，加入MOI值為50的LV-Omp25-GFP50ul感染BV2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，72h后收集實(shí)

4、驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，RT-PCR及ELISA檢測(cè)炎性因子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①慢病毒感染BV2細(xì)胞72小時(shí)后，在熒光倒置顯微鏡下觀察LV-GFP組和LV-Omp25-GFP組熒光顯微鏡下可見(jiàn)GFP的表達(dá)，約有超過(guò)85％的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，空白對(duì)照組由于未感染慢病毒，熒光顯微鏡下未見(jiàn)GFP的表達(dá)。
　?、贓LISA結(jié)果顯示

5、，感染72h后，LV-Omp25-GFP組與空白組及LV-GFP組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.05）,LV-GFP與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?、鄱縋CR結(jié)果顯示：以空白對(duì)照組為1進(jìn)行比較，慢病毒組Omp25基因的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，其表達(dá)量較空白對(duì)照組和GFP組明顯上調(diào)，差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而GFP組與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明BV2細(xì)胞成功過(guò)

6、表達(dá)Omp25基因。
　?、躓estern blot結(jié)果：LV-Omp25-GFP組較對(duì)照組所檢測(cè)灰度值升高，提示Omp25慢病毒感染BV2細(xì)胞后Omp25蛋白成功過(guò)表達(dá)。
　　⑤電子透射電鏡結(jié)果顯示：LV-Omp25-GFP組較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)長(zhǎng)且豐富的偽足，大量的脂質(zhì)空泡、髓樣小體，線(xiàn)粒體嵴被大量破壞，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有一些大小不等的吞噬泡,其中含多少不等的慢病毒顆粒凝聚，溶酶體增多。
　?、轇V2細(xì)胞用BAY11-70

7、82預(yù)處理60min后轉(zhuǎn)染LV-Omp25-GFP，72h收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清，熒光定量及ELISA分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)TNF-α、IL-6、NO的表達(dá)。
　　結(jié)果：顯示加入信號(hào)通路抑制劑后能夠明顯抑制Omp25過(guò)表達(dá)慢病毒誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生，證明NF-κB信號(hào)通路可能參與誘導(dǎo)促炎因子TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生。
　　結(jié)論：建立Omp25慢病毒過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞的模型，推測(cè)BV2細(xì)胞通過(guò)內(nèi)