核轉(zhuǎn)錄因子NRF2在砷誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞毒性損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 砷廣泛存在于自然界中，包括無(wú)機(jī)砷和有機(jī)砷。人類可以通過(guò)環(huán)境、職業(yè)暴露或者使用含砷藥物而接觸到無(wú)機(jī)砷，長(zhǎng)期砷暴露可引發(fā)多種疾病，大量流行病學(xué)調(diào)查資料顯示：砷污染是暴露人群的2型糖尿病發(fā)生的重要因素之一。但砷導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生的機(jī)制仍不明確，目前，醫(yī)學(xué)界認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是造成2型糖尿病胰島β細(xì)胞損傷的重要病理機(jī)制之一，而砷中毒發(fā)病機(jī)制的重要理論就是氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)，因此砷暴露導(dǎo)致胰島β細(xì)胞毒性損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄

2、因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2)屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族成員，是啟動(dòng)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)控因子。因此在本研究中，首先，應(yīng)用穩(wěn)定的Nrf2基因沉默小鼠胰島β細(xì)胞MIN6和從Nrf2基因敲除小鼠中分離的胰島，在急性高劑量砷暴露的條件下，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、MTT、流式細(xì)胞儀等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察砷暴露導(dǎo)致的細(xì)胞毒性在Nrf2基因沉默MIN6細(xì)胞和Nrf2基因敲除的胰島中的變化；

3、其次，應(yīng)用qReal-time RT-PCR和Western Blotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)砷對(duì)Nrf2及其ARE目的基因表達(dá)的影響。從而闡明Nrf2在砷誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞和分離的胰島抗氧化反應(yīng)和細(xì)胞毒性過(guò)程中的作用機(jī)制，為預(yù)防和治療砷致糖尿病提供理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6
　　 2、建立Nrf2基因沉默小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6
　　 3、通過(guò)MTT法檢測(cè)急

4、性砷暴露對(duì)Scr和Nrf2-KD細(xì)胞的急性細(xì)胞毒性損傷情況
　　 4、利用流式細(xì)胞儀和Western Blotting檢測(cè)急性砷誘導(dǎo)Scr和Nrf2-KD細(xì)胞的凋亡情況
　　 5、利用相差顯微鏡觀察急性砷暴露對(duì)WT和Nrf2-KO小鼠胰島毒性損傷情況
　　 6、利用qReal-time RT-PCR和Western Blotting檢測(cè)急性砷暴露對(duì)Nrf2的基因和蛋白的表達(dá)情況
　　 7、利用qReal-

5、time RT-PCR檢測(cè)急性砷暴露對(duì)ARE目的基因的表達(dá)情況
　　 8、利用qReal-time RT-PCR檢測(cè)急性砷暴露對(duì)Nrf2基因敲除的小鼠胰島Nrf2和ARE目的基因的表達(dá)影響
　　 9、應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析與制圖
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、建立Nrf2基因沉默小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6
　　 qReal-time RT-PCR和Western B

6、lotting結(jié)果顯示：Nrf2基因沉默(Nrf2-KD)細(xì)胞Nrf2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于Scr細(xì)胞。
　　 2、急性砷暴露對(duì)Scr和Nrf2-KD細(xì)胞的急性細(xì)胞毒性
　　 應(yīng)用2、4、6、8、10、12、14、16μM的亞砷酸鈉和0.5、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μM MMA3+處理Scr和Nrf2-KD細(xì)胞24 hrs，Scr和Nrf2-KD細(xì)胞活性均隨著亞砷酸鈉和MMA3+濃度的增高而逐漸

7、變低，Nrf2-KD細(xì)胞對(duì)亞砷酸鈉和MMA3+的急性毒性比Scr細(xì)胞更敏感。
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)急性砷誘導(dǎo)Scr和Nrf2-KD細(xì)胞凋亡
　　 應(yīng)用6、8和10μM的亞砷酸鈉處理Scr和Nrf2-KD細(xì)胞24 hrs，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Nrf2-KD細(xì)胞凋亡比例較同劑量組Scr組增高。
　　 4、Western Blotting檢測(cè)急性砷誘導(dǎo)Scr和Nrf2-KD細(xì)胞caspase-3的表

8、達(dá)
　　 應(yīng)用2、4、6、8和10μM的亞砷酸鈉處理Scr和Nrf2-KD細(xì)胞24 hrs，WesternBlotting檢測(cè)cleaved-caspase-3，結(jié)果顯示：Nrf2-KD細(xì)胞表達(dá)量明顯高于同劑量組Scr細(xì)胞。
　　 5、急性砷暴露對(duì)tBHQ預(yù)處理的Scr和Nrf2-KD細(xì)胞的毒性損傷
　　 Scr細(xì)胞被50μM tBHQ預(yù)處理6hrs后，再經(jīng)不同劑量(4、6、8、10、12μM)的亞砷酸鈉處理24

9、hrs，結(jié)果可見(jiàn)經(jīng)tBHQ預(yù)處理后的Scr細(xì)胞活性上調(diào)，而Nrf2-KD細(xì)胞中未見(jiàn)到細(xì)胞活性有改變。
　　 6、急性砷暴露對(duì)Nrf2基因敲除的小鼠胰島的毒性損傷
　　 分離的胰島在體外培養(yǎng)48hrs后，分三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組、iAS3+20μM染毒組、iAS3+50μM染毒組；每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均由各100個(gè)隨機(jī)挑選的WT小鼠胰島組和Nrf2-KO小鼠胰島組構(gòu)成，在不同時(shí)間點(diǎn)(8、12、16、24hrs)用倒置顯微鏡觀察每個(gè)實(shí)驗(yàn)組

10、存留的胰島數(shù)量并照相。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：Nrf2-KO小鼠胰島對(duì)亞砷酸鈉毒性損傷比WT更敏感。
　　 7、急性砷暴露對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞Nrf2基因與蛋白表達(dá)的影響
　　 Scr和Nrf2-KD細(xì)胞暴露于不同濃度的亞砷酸鈉(2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亞砷酸鈉不同時(shí)間點(diǎn)(2、6、12、18、24hrs)，結(jié)果顯示：亞砷酸鈉對(duì)Scr細(xì)胞總Nrf2和核內(nèi)Nrf2蛋白水平的激活作用存在明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)，但對(duì)Nrf2的

11、mRNA表達(dá)影響不顯著。Nrf2-KD細(xì)胞與Scr細(xì)胞相比時(shí)間和劑量效應(yīng)不顯著。
　　 8、急性砷暴露致小鼠胰島β細(xì)胞ARE目的基因表達(dá)的影響
　　 Scr和Nrf2-KD細(xì)胞暴露于不同濃度的亞砷酸鈉(0、2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亞砷酸鈉不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、6、12、18、24hrs)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，亞砷酸鈉對(duì)ARE目的基因(Nqol、Hmox-1、Gclc、Srx)激活作用存在明顯的時(shí)間和劑量效應(yīng)，N

12、rf2-KD細(xì)胞與Scr細(xì)胞相比時(shí)間和劑量效應(yīng)不顯著。
　　 9、急性砷暴露對(duì)Nrf2基因敲除的小鼠胰島Nrf2和ARE目的基因的表達(dá)影響
　　 WT和Nrf2-KO小鼠胰島暴露于5μM亞砷酸鈉6hrs，結(jié)果表明，生理?xiàng)l件下或亞砷酸鈉染毒，Nrf2-KO小鼠胰島均未見(jiàn)Nrf2表達(dá)。在正常生理?xiàng)l件下，ARE目的基因Nqol、Hmox-1、Gclc、和Srx在Nrf2-KO小鼠胰島中表達(dá)均低于WT小鼠胰島，亞砷酸鈉染毒后，W

13、T小鼠胰島的ARE目的基因顯著升高，而Nrf2-KO小鼠胰島ARE目的基因表達(dá)增高不顯著。
　　 結(jié)論：
　　 1、Nrf2基因沉默的小鼠胰島β細(xì)胞MIN6對(duì)急性砷暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷更敏感。
　　 2、Nrf2基因敲除的小鼠胰島對(duì)急性砷暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷更敏感。
　　 3、Nrf2基因沉默的小鼠胰島β細(xì)胞MIN6明顯降低了抵抗急性砷暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力
　　 4、Nrf2基因敲除的