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文檔簡(jiǎn)介
1、1.背景:
鎘及其化合物是重要的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物,具有較強(qiáng)的蓄積性,生物半衰期較長(zhǎng)。被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為1類致癌物,可以誘發(fā)多種腫瘤,大量流行病學(xué)與實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)通過職業(yè)接觸、吸煙和攝入受污染的食物(谷類、蔬菜)等途徑鎘暴露會(huì)引起腎、肝、肺、生殖系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等疾病,甚至導(dǎo)致相關(guān)腫瘤的發(fā)生。鎘致癌作用機(jī)制研究方面有學(xué)者提出了氧化應(yīng)激、信號(hào)通路改變、細(xì)胞增殖與凋亡異常、金屬硫蛋白缺乏、表觀遺傳學(xué)等假說,但這些遺
2、傳學(xué)假說還沒有完全闡明鎘的毒性機(jī)制。Smoothelin(SMTN)基因位于染色體22q12.3,只在完全分化的平滑肌組織中豐富表達(dá)。既往的研究主要是利用SMTN鑒別固有肌層和粘膜肌層,也有研究發(fā)現(xiàn)SMTN影響消化道、心血管等內(nèi)臟收縮功能,但在環(huán)境化學(xué)物損傷機(jī)制國(guó)內(nèi)外皆無報(bào)道。本研究擬在細(xì)胞、動(dòng)物水平探討SMTN基因作為鎘毒作用新分子標(biāo)志物的可能性。首先在鎘惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelial
3、 cell,16HBE)模型上用qPCR技術(shù)驗(yàn)證SMTN基因的差異表達(dá),RNA干擾技術(shù)(siRNA)穩(wěn)定沉默SMTN基因表達(dá)后檢測(cè)細(xì)胞一般生物學(xué)性狀的改變(形態(tài)、生長(zhǎng)周期、細(xì)胞周期),且在SMTN基因穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞檢測(cè)SMTN對(duì)細(xì)胞急性鎘毒性的影響(細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡、DNA損傷)。進(jìn)一步檢測(cè)亞慢性鎘染毒大鼠模型組織中SMTN基因表達(dá)情況,分析SMTN表達(dá)水平與鎘暴露的關(guān)系,從動(dòng)物水平探討SMTN的功能。
2.目的:
4、 2.1.在本課題組前期已經(jīng)建立的的鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,對(duì)16HBE細(xì)胞進(jìn)行生物信息學(xué)方法分析,發(fā)現(xiàn)16HBE細(xì)胞 mRNA表達(dá)譜出現(xiàn)了SMTN基因的差異化表達(dá),通過進(jìn)一步的研究,查找資料對(duì)該基因的位點(diǎn)、形態(tài)、大小及保守性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析。
2.2.在氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化不同階段16HBE細(xì)胞中驗(yàn)證SMTN的差異表達(dá);用氯化鎘(不同時(shí)間、不同劑量)染毒16HBE細(xì)胞,觀察SMTN mRNA表達(dá)變化,探討SMT
5、N基因在鎘致細(xì)胞毒性急性損傷中的表達(dá)。
2.3.采用RNA干擾技術(shù)穩(wěn)定沉默SMTN的表達(dá)后,研究SMTN低表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)周期、細(xì)胞周期等一般生物學(xué)特性的影響,探討SMTN基因在鎘惡性轉(zhuǎn)化毒性中的作用。用氯化鎘(不同時(shí)間、不同劑量)染毒16HBE穩(wěn)定SMTN沉默細(xì)胞株,觀察細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡,DNA損傷,探討SMTN基因在鎘致細(xì)胞毒性損傷中的作用。
2.4.在本課題組前期建立的亞慢性鎘染毒動(dòng)物模型,觀察亞慢性染
6、毒后組織(肺、心、肝、腎)中SMTN mRNA的表達(dá)規(guī)律,探討SMTN在鎘致動(dòng)物損傷模型組織中的作用。
3.方法:
3.1.qPCR技術(shù)檢測(cè)SMTN基因的表達(dá)
運(yùn)用qPCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)本課題組前期建立的氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞系不同階段細(xì)胞SMTN基因的表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)不同劑量(0、10、20、30、40μmol/L)、不同時(shí)間(0、12、24、48、72 h)氯化鎘急性染毒后SMTN基因的表達(dá)水平。
7、> 3.2.構(gòu)建穩(wěn)定SMTN缺陷細(xì)胞株并檢測(cè)其一般生物學(xué)功能
利用慢病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),把SMTN的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)載體導(dǎo)入16HBE細(xì)胞,并將pCDH空載體作為對(duì)照。用嘌呤霉素篩選后分別命名16HBE-shSMTN,16HBE-pCDH,用qRT-PCR驗(yàn)證SMTN基因缺陷細(xì)胞株mRNA的表達(dá)。并觀察缺陷細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期等一般生物學(xué)特征。
3.3.SMTN缺陷對(duì)鎘致細(xì)胞急性
8、損傷的影響
在穩(wěn)定SMTN缺陷細(xì)胞株上同時(shí)檢測(cè)不同劑量(0、10、20、30、40μmol/L)、不同時(shí)間(0、12、24、48、72h)氯化鎘染毒,檢測(cè)細(xì)胞的抑制率、細(xì)胞凋亡率、DNA損傷。
3.4.在課題組前期構(gòu)建的亞慢性鎘染毒大鼠模型中研究SMTN的表達(dá)
使用SPF級(jí)別SD大鼠,共四個(gè)劑量組:0.9%NaCl(對(duì)照組),0.306mg/kg(低劑量組),0.612mg/kg(中劑量組)和1.225mg
9、/kg(高劑量組);腹腔注射,連續(xù)染毒14周,每周染毒5次,用采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠體內(nèi)主要臟器(肺、心、肝和腎臟組織)中SMTN表達(dá)情況。
3.5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MTT、qRT-PCR、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞計(jì)數(shù)等每個(gè)樣本3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,SMTN基因mRNA的相對(duì)含量、細(xì)胞抑制率、凋亡率等均以mean±SD表示。三組及以上組間均數(shù)比較采用單因素方差分析
10、,組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett T3法;以а=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采取TriTek CometScoreTM彗星評(píng)分軟件來測(cè)量各組彗星尾長(zhǎng)(tail length,TL)、尾距(tail moment)、Olive尾距(Olive tail moment,OTM)、尾部DNA含量(Tail DNA%)。數(shù)據(jù)整理后錄入統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行分析,以P<0.05為顯著性
11、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
4.結(jié)果:
4.1.惡性轉(zhuǎn)化過程中SMTN表達(dá)變化
qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,鎘致16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中SMTN在惡性轉(zhuǎn)化前細(xì)胞(14th)和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞(35th)中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá),與未染毒對(duì)照組相比,14th和35th分別增加0.91倍和3.26倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果表明SMTN在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)升高,且與惡性轉(zhuǎn)化程度密切相關(guān)。
4.2.SMTN基
12、因在鎘致16HBE急性損傷中的表達(dá)
分別用10、20、30、40μmol/L CdCl2處理16HBE細(xì)胞24 h,利用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞SMTN基因表達(dá),20、30、40μmol/L處理組細(xì)胞SMTN mRNA相對(duì)表達(dá)分別2.943±0.212,10.602±1.334,3.782±4.571,與CdCl2未處理對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01),且隨著CdCl2染毒劑量的上升,SMTN mRNA表達(dá)逐漸升高。
13、r> 4.3.SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞一般生物學(xué)性狀的影響
利用慢病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),成功構(gòu)建SMTN缺陷細(xì)胞株16HBE-shSMTN細(xì)胞,SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增值率和細(xì)胞周期沒有明顯影響。
4.4.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞急性損傷的影響
4.4.1.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比(16HBE),鎘致SMTN缺陷細(xì)胞株在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無明顯差異。利用Annexin
14、 V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)16HBE細(xì)胞急性染毒模型細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示,在10和20μmol/L CdCl2處理?xiàng)l件下,16HBE-shSMTN細(xì)胞細(xì)胞凋亡率分別下降11.9%、17.7%,差異具有顯著性(P<0.05),表明在一定劑量范圍內(nèi)(低于LD50)低表達(dá)SMTN可以抑制細(xì)胞凋亡。
4.4.2.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞DNA損傷的影響利用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(彗星實(shí)驗(yàn)),與同組16HBE細(xì)胞相比,10、
15、20、30μmol/L CdCl2處理16HBE-shSMTN細(xì)胞TL、TD(%)、TM和OTM值均顯著性升高(P<0.05)。不同時(shí)間梯度鎘處理細(xì)胞,20μmol/L鎘染毒16HBE-shSMTN細(xì)胞TL、TD(%)、TM和OTM值指標(biāo)均高于相同處理的16HBE細(xì)胞與16HBE-pCDH細(xì)胞(P<0.05)。表明低表達(dá)SMTN可以加重CdCl2所致的DNA損傷。
4.5.大鼠模型組織中SMTN的表達(dá)規(guī)律
在亞慢性鎘
16、染毒大鼠模型肺、心、肝、腎各組織中 SMTN均呈上調(diào)表達(dá),肺組織各染毒組(低、中和高劑量組)SMTN的表達(dá)量分別為對(duì)照組的(3.2±0.43)倍、(8±1.02)倍和(5±0.63)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);心臟組織各染毒組低、中和高劑量組SMTN的表達(dá)量分別為對(duì)照組的(2.5±0.33)倍、(1.6±0.22)倍及(3.7±0.54)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);肝臟組織低、中、高染毒組分別為對(duì)照組的(1.8±0.
17、23)倍、(6.96±0.82)倍和(4.0±0.64)倍,差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);腎臟組織低、中、高染毒組分別為未染毒對(duì)照組的(3.3±0.39)倍、(1.5±0.24)倍及(1.9±0.29)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
5.結(jié)論:
5.1.SMTN基因在氯化鎘致16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型中表達(dá)增加,并與惡性轉(zhuǎn)化程度密切相關(guān);在不同劑量、不同時(shí)間氯化鎘急性染毒過程中,SMTN基因隨著劑量的增
18、加表達(dá)升高,存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。提示SMTN在鎘致細(xì)胞急性損傷及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中處于高表達(dá)的狀態(tài)。
5.2.SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增值率和細(xì)胞周期沒有明顯影響,但在氯化鎘中等劑量(10和20μmol/L)作用下,細(xì)胞凋亡降低,提示在鎘致細(xì)胞急性損傷過程中 SMTN可能影響細(xì)胞凋亡。通過彗星實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)在不同濃度梯度和時(shí)間梯度下處理,SMTN低表達(dá)組細(xì)胞組的損傷指標(biāo)值明顯上升, SMTN基因低
19、表達(dá)狀態(tài)下鎘致細(xì)胞DNA損傷情況加重,提示SMTN基因可能參與鎘致細(xì)胞急性DNA損傷作用過程。
5.3.亞慢性鎘染毒大鼠模型組織(肺、心、肝和腎臟)組織SMTN均呈上調(diào)表達(dá),其表達(dá)水平與鎘暴露水平呈不同程度的相關(guān)關(guān)系。
從細(xì)胞、動(dòng)物兩個(gè)方面初步提示:SMTN在鎘致細(xì)胞損傷早期即出現(xiàn)異常表達(dá),且在惡性轉(zhuǎn)化過程中保持高表達(dá)狀態(tài),可能通過影響細(xì)胞凋亡、DNA損傷從而參與細(xì)胞急性毒性損傷過程。這為 SMTN作為新的鎘早期接觸
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