Smoothelin在鎘致16HBE細(xì)胞毒性損傷中的作用.pdf

1、1.背景：
　　鎘及其化合物是重要的工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，具有較強(qiáng)的蓄積性，生物半衰期較長(zhǎng)。被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為1類致癌物，可以誘發(fā)多種腫瘤，大量流行病學(xué)與實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)通過職業(yè)接觸、吸煙和攝入受污染的食物（谷類、蔬菜）等途徑鎘暴露會(huì)引起腎、肝、肺、生殖系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等疾病，甚至導(dǎo)致相關(guān)腫瘤的發(fā)生。鎘致癌作用機(jī)制研究方面有學(xué)者提出了氧化應(yīng)激、信號(hào)通路改變、細(xì)胞增殖與凋亡異常、金屬硫蛋白缺乏、表觀遺傳學(xué)等假說，但這些遺

2、傳學(xué)假說還沒有完全闡明鎘的毒性機(jī)制。Smoothelin（SMTN）基因位于染色體22q12.3，只在完全分化的平滑肌組織中豐富表達(dá)。既往的研究主要是利用SMTN鑒別固有肌層和粘膜肌層，也有研究發(fā)現(xiàn)SMTN影響消化道、心血管等內(nèi)臟收縮功能,但在環(huán)境化學(xué)物損傷機(jī)制國(guó)內(nèi)外皆無報(bào)道。本研究擬在細(xì)胞、動(dòng)物水平探討SMTN基因作為鎘毒作用新分子標(biāo)志物的可能性。首先在鎘惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞（Human bronchial epithelial

3、 cell，16HBE）模型上用qPCR技術(shù)驗(yàn)證SMTN基因的差異表達(dá)，RNA干擾技術(shù)（siRNA）穩(wěn)定沉默SMTN基因表達(dá)后檢測(cè)細(xì)胞一般生物學(xué)性狀的改變（形態(tài)、生長(zhǎng)周期、細(xì)胞周期），且在SMTN基因穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞檢測(cè)SMTN對(duì)細(xì)胞急性鎘毒性的影響（細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡、DNA損傷）。進(jìn)一步檢測(cè)亞慢性鎘染毒大鼠模型組織中SMTN基因表達(dá)情況，分析SMTN表達(dá)水平與鎘暴露的關(guān)系，從動(dòng)物水平探討SMTN的功能。
　　2.目的：

4、　　2.1.在本課題組前期已經(jīng)建立的的鎘惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，對(duì)16HBE細(xì)胞進(jìn)行生物信息學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)16HBE細(xì)胞 mRNA表達(dá)譜出現(xiàn)了SMTN基因的差異化表達(dá)，通過進(jìn)一步的研究，查找資料對(duì)該基因的位點(diǎn)、形態(tài)、大小及保守性等生物學(xué)特性進(jìn)行分析。
　　2.2.在氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化不同階段16HBE細(xì)胞中驗(yàn)證SMTN的差異表達(dá)；用氯化鎘（不同時(shí)間、不同劑量）染毒16HBE細(xì)胞，觀察SMTN mRNA表達(dá)變化，探討SMT

5、N基因在鎘致細(xì)胞毒性急性損傷中的表達(dá)。
　　2.3.采用RNA干擾技術(shù)穩(wěn)定沉默SMTN的表達(dá)后，研究SMTN低表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)周期、細(xì)胞周期等一般生物學(xué)特性的影響，探討SMTN基因在鎘惡性轉(zhuǎn)化毒性中的作用。用氯化鎘（不同時(shí)間、不同劑量）染毒16HBE穩(wěn)定SMTN沉默細(xì)胞株，觀察細(xì)胞抑制率、細(xì)胞凋亡，DNA損傷，探討SMTN基因在鎘致細(xì)胞毒性損傷中的作用。
　　2.4.在本課題組前期建立的亞慢性鎘染毒動(dòng)物模型，觀察亞慢性染

6、毒后組織（肺、心、肝、腎）中SMTN mRNA的表達(dá)規(guī)律，探討SMTN在鎘致動(dòng)物損傷模型組織中的作用。
　　3.方法：
　　3.1.qPCR技術(shù)檢測(cè)SMTN基因的表達(dá)
　　運(yùn)用qPCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)本課題組前期建立的氯化鎘惡性轉(zhuǎn)化模型細(xì)胞系不同階段細(xì)胞SMTN基因的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)不同劑量（0、10、20、30、40μmol/L）、不同時(shí)間（0、12、24、48、72 h）氯化鎘急性染毒后SMTN基因的表達(dá)水平。

7、>　　3.2.構(gòu)建穩(wěn)定SMTN缺陷細(xì)胞株并檢測(cè)其一般生物學(xué)功能
　　利用慢病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，把SMTN的短發(fā)夾雙鏈RNA(shRNA)載體導(dǎo)入16HBE細(xì)胞，并將pCDH空載體作為對(duì)照。用嘌呤霉素篩選后分別命名16HBE-shSMTN，16HBE-pCDH，用qRT-PCR驗(yàn)證SMTN基因缺陷細(xì)胞株mRNA的表達(dá)。并觀察缺陷細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞周期等一般生物學(xué)特征。
　　3.3.SMTN缺陷對(duì)鎘致細(xì)胞急性

8、損傷的影響
　　在穩(wěn)定SMTN缺陷細(xì)胞株上同時(shí)檢測(cè)不同劑量（0、10、20、30、40μmol/L）、不同時(shí)間（0、12、24、48、72h）氯化鎘染毒，檢測(cè)細(xì)胞的抑制率、細(xì)胞凋亡率、DNA損傷。
　　3.4.在課題組前期構(gòu)建的亞慢性鎘染毒大鼠模型中研究SMTN的表達(dá)
　　使用SPF級(jí)別SD大鼠，共四個(gè)劑量組：0.9％NaCl（對(duì)照組），0.306mg/kg（低劑量組），0.612mg/kg（中劑量組）和1.225mg

9、/kg（高劑量組）；腹腔注射，連續(xù)染毒14周，每周染毒5次，用采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠體內(nèi)主要臟器（肺、心、肝和腎臟組織）中SMTN表達(dá)情況。
　　3.5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MTT、qRT-PCR、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞計(jì)數(shù)等每個(gè)樣本3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，SMTN基因mRNA的相對(duì)含量、細(xì)胞抑制率、凋亡率等均以mean±SD表示。三組及以上組間均數(shù)比較采用單因素方差分析

10、，組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett T3法；以а=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析采取TriTek CometScoreTM彗星評(píng)分軟件來測(cè)量各組彗星尾長(zhǎng)(tail length,TL)、尾距（tail moment）、Olive尾距(Olive tail moment,OTM)、尾部DNA含量(Tail DNA%)。數(shù)據(jù)整理后錄入統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS13.0進(jìn)行分析，以P＜0.05為顯著性

11、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　4.結(jié)果：
　　4.1.惡性轉(zhuǎn)化過程中SMTN表達(dá)變化
　　qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，鎘致16HBE細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中SMTN在惡性轉(zhuǎn)化前細(xì)胞（14th）和惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞（35th）中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，與未染毒對(duì)照組相比，14th和35th分別增加0.91倍和3.26倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明SMTN在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)升高，且與惡性轉(zhuǎn)化程度密切相關(guān)。
　　4.2.SMTN基

12、因在鎘致16HBE急性損傷中的表達(dá)
　　分別用10、20、30、40μmol/L CdCl2處理16HBE細(xì)胞24 h，利用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞SMTN基因表達(dá)，20、30、40μmol/L處理組細(xì)胞SMTN mRNA相對(duì)表達(dá)分別2.943±0.212，10.602±1.334，3.782±4.571，與CdCl2未處理對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01），且隨著CdCl2染毒劑量的上升，SMTN mRNA表達(dá)逐漸升高。

13、r>　　4.3.SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞一般生物學(xué)性狀的影響
　　利用慢病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功構(gòu)建SMTN缺陷細(xì)胞株16HBE-shSMTN細(xì)胞，SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增值率和細(xì)胞周期沒有明顯影響。
　　4.4.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞急性損傷的影響
　　4.4.1.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比（16HBE），鎘致SMTN缺陷細(xì)胞株在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無明顯差異。利用Annexin

14、 V-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)16HBE細(xì)胞急性染毒模型細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，在10和20μmol/L CdCl2處理?xiàng)l件下，16HBE-shSMTN細(xì)胞細(xì)胞凋亡率分別下降11.9%、17.7%，差異具有顯著性（P＜0.05），表明在一定劑量范圍內(nèi)（低于LD50）低表達(dá)SMTN可以抑制細(xì)胞凋亡。
　　4.4.2.SMTN低表達(dá)對(duì)鎘致細(xì)胞DNA損傷的影響利用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)（彗星實(shí)驗(yàn)），與同組16HBE細(xì)胞相比，10、

15、20、30μmol/L CdCl2處理16HBE-shSMTN細(xì)胞TL、TD（%）、TM和OTM值均顯著性升高（P＜0.05）。不同時(shí)間梯度鎘處理細(xì)胞，20μmol/L鎘染毒16HBE-shSMTN細(xì)胞TL、TD（%）、TM和OTM值指標(biāo)均高于相同處理的16HBE細(xì)胞與16HBE-pCDH細(xì)胞（P＜0.05）。表明低表達(dá)SMTN可以加重CdCl2所致的DNA損傷。
　　4.5.大鼠模型組織中SMTN的表達(dá)規(guī)律
　　在亞慢性鎘

16、染毒大鼠模型肺、心、肝、腎各組織中 SMTN均呈上調(diào)表達(dá)，肺組織各染毒組（低、中和高劑量組）SMTN的表達(dá)量分別為對(duì)照組的（3.2±0.43）倍、（8±1.02）倍和（5±0.63）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；心臟組織各染毒組低、中和高劑量組SMTN的表達(dá)量分別為對(duì)照組的（2.5±0.33）倍、（1.6±0.22）倍及（3.7±0.54）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝臟組織低、中、高染毒組分別為對(duì)照組的（1.8±0.

17、23）倍、（6.96±0.82）倍和（4.0±0.64）倍，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腎臟組織低、中、高染毒組分別為未染毒對(duì)照組的（3.3±0.39）倍、（1.5±0.24）倍及（1.9±0.29）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.結(jié)論：
　　5.1.SMTN基因在氯化鎘致16HBE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型中表達(dá)增加，并與惡性轉(zhuǎn)化程度密切相關(guān)；在不同劑量、不同時(shí)間氯化鎘急性染毒過程中，SMTN基因隨著劑量的增

18、加表達(dá)升高，存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。提示SMTN在鎘致細(xì)胞急性損傷及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中處于高表達(dá)的狀態(tài)。
　　5.2.SMTN缺陷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞增值率和細(xì)胞周期沒有明顯影響，但在氯化鎘中等劑量（10和20μmol/L）作用下，細(xì)胞凋亡降低，提示在鎘致細(xì)胞急性損傷過程中 SMTN可能影響細(xì)胞凋亡。通過彗星實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)在不同濃度梯度和時(shí)間梯度下處理，SMTN低表達(dá)組細(xì)胞組的損傷指標(biāo)值明顯上升， SMTN基因低

19、表達(dá)狀態(tài)下鎘致細(xì)胞DNA損傷情況加重，提示SMTN基因可能參與鎘致細(xì)胞急性DNA損傷作用過程。
　　5.3.亞慢性鎘染毒大鼠模型組織（肺、心、肝和腎臟）組織SMTN均呈上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)水平與鎘暴露水平呈不同程度的相關(guān)關(guān)系。
　　從細(xì)胞、動(dòng)物兩個(gè)方面初步提示：SMTN在鎘致細(xì)胞損傷早期即出現(xiàn)異常表達(dá)，且在惡性轉(zhuǎn)化過程中保持高表達(dá)狀態(tài)，可能通過影響細(xì)胞凋亡、DNA損傷從而參與細(xì)胞急性毒性損傷過程。這為 SMTN作為新的鎘早期接觸