金屬硫蛋白對(duì)阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、阿霉素(DOX)為臨床常用的廣譜、高效抗腫瘤藥物，廣泛用于急慢性白血病、各種實(shí)體瘤等多種癌癥的化療。然而，DOX具有明顯的心臟毒性，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。DOX在體內(nèi)代謝過程中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，過量的ROS攻擊心肌細(xì)胞引起氧化損傷可能是DOX致心臟毒性的主要原因。金屬硫蛋白(MT)是一類富含還原型半胱氨酸殘基的低分子量非酶蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各種器官和組織中。目前研究發(fā)現(xiàn)MT有四種異構(gòu)體，即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT

2、-Ⅲ、MT-Ⅳ，其中以MT-Ⅰ，MT-Ⅱ?yàn)橹饕悩?gòu)形式。通常所指的MT即為MT-Ⅰ和MT-Ⅱ，幾乎存在于機(jī)體所有的組織器官，尤其以肝臟和腎臟含量最為豐富。機(jī)體內(nèi)MT主要與Zn2+、Cd2+、Cu2+等二價(jià)金屬離子絡(luò)合，能廣泛地被重金屬、炎癥、感染、休克、饑餓、電離輻射、抗癌藥物等因素誘導(dǎo)表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)研究表明，MT能有效清除細(xì)胞內(nèi)過多的自由基；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提示，氧化應(yīng)激狀態(tài)下MT可能對(duì)機(jī)體組織器官具有重要的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制目前尚不

3、清楚。近年來，應(yīng)用基因敲除技術(shù)建立的MT缺失小鼠動(dòng)物模型為研究機(jī)體內(nèi)MT生物學(xué)功能及其作用機(jī)制提供了有力工具。本研究利用C57BL野生型小鼠及同源的MT基因(Ⅰ／Ⅱ)敲除小鼠研究DOX的心臟毒性效應(yīng)，著重從氧化損傷及細(xì)胞凋亡等方面探討MT對(duì)DOX致心臟毒性的影響并探討其可能的作用機(jī)制。 1.Zn誘導(dǎo)金屬硫蛋白表達(dá)對(duì)阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用及其可能機(jī)制 Zn是一種高效而且安全的MT誘導(dǎo)劑。近年來研究表明，Zn預(yù)處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4、可顯著減弱DOX所致的心肌脂質(zhì)過氧化而保護(hù)心臟，但其作用機(jī)制仍不清楚。本研究采用Zn預(yù)處理野生型小鼠(MT+／+)誘導(dǎo)MT高表達(dá)建立MT高表達(dá)模型，結(jié)合MT缺失模型(MT-／-)，觀察MT不同表達(dá)水平對(duì)DOX致心臟損傷的影響，探討MT抗DOX心臟毒性的可能機(jī)制。MT+／+小鼠及MT-／-小鼠分別隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組(NS+NS)、給藥組(NS+DOX)、預(yù)處理組(Zn+NS)、預(yù)處理給藥組(Zn+DOX)。動(dòng)物單次腹腔注射DOX(15

5、mg／kg)或等劑量的生理鹽水(NS)，此前24h及48h分別給予ZnSO4(20mg／kg，s．c)或等劑量的NS預(yù)處理。DOX給藥后第4d，眼球采血測(cè)定血漿肌酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)活性；光學(xué)顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察心臟組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變；測(cè)定心臟組織勻漿中MT和Zn水平；分別檢測(cè)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)及蛋白羰基化產(chǎn)物含量以觀察心肌組織脂質(zhì)過氧化和蛋白氧化損傷程度；測(cè)定抗氧化物還原型谷胱甘肽(GSH)含

6、量以及組織中超氧陰離子(O2·-)濃度；WesternBlot檢測(cè)心臟組織中DOX的主要代謝酶eNOS表達(dá)情況。結(jié)果表明，Zn預(yù)處理可提高M(jìn)T+／+小鼠及MT-／-小鼠心臟組織中Zn水平但僅誘導(dǎo)MT+／+小鼠心臟MT高表達(dá)，且MT-/-小鼠心臟MT含量顯著低于MT+／+小鼠心臟MT正常水平；DOX能引起MT+／+小鼠及MT-／-小鼠心臟嚴(yán)重的損傷，而且MT-／-小鼠心臟損傷程度比MT+／+小鼠更為明顯。具體表現(xiàn)為，光鏡及電鏡下可見心肌組

7、織明顯的的病理學(xué)改變，血漿CK、LDH活性升高，心臟組織MDA及蛋白羰基化產(chǎn)物含量增加，GSH耗竭伴隨著O2·-生成量增加以及eNOS表達(dá)上調(diào)。在MT+／+小鼠中，Zn預(yù)處理可顯著抑制DOX所致的這些心臟毒性改變；但Zn預(yù)處理再給予DOX的MT-／-小鼠心臟仍然出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷，提示Zn預(yù)處理對(duì)DOX誘發(fā)的MT-／-小鼠心臟損傷沒有抑制作用。由此提示，Zn誘導(dǎo)MT表達(dá)增強(qiáng)可顯著抑制DOX引起的心臟損傷，機(jī)體內(nèi)基礎(chǔ)水平的MT對(duì)DOX心臟毒性

8、也有一定的保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zn誘導(dǎo)MT表達(dá)對(duì)DOX心臟毒性具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與MT體內(nèi)清除自由基的功能有關(guān)，eNOS可能在此過程中發(fā)揮重要的作用。 2．金屬硫蛋白對(duì)阿霉素致心肌線粒體損傷及細(xì)胞凋亡的影響 心肌細(xì)胞凋亡是DOX引起心肌病的主要原因。近年來體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，自由基介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可能在DOX致心肌病變過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。線粒體是DOX誘發(fā)自由基產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，線粒體損傷及其功能紊

9、亂是DOX致心肌細(xì)胞凋亡的早期征兆。我們假設(shè)：MT可能通過清除過多的自由基，保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體而抑制DOX致Caspase-3的活化，從而抑制DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡，減輕DOX的心臟毒性。MT+／+小鼠及MT-／-小鼠分別隨機(jī)分成2組，即對(duì)照組和給藥組。給藥組動(dòng)物單次腹腔注射DOX(15mg／kg)，對(duì)照組給予等劑量的NS處理。給藥后第4d處死動(dòng)物，迅速摘取心臟。采用透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體形態(tài)學(xué)改變，測(cè)定心肌組織Caspase-

10、3活性，TUNEL免疫組化法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，DOX可引起MT+／+小鼠及MT-／-小鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的明顯改變，表現(xiàn)為線粒體空泡化、膜明顯皺縮甚至溶解、嵴斷裂或消失等；DOX可明顯激活Caspase-3并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而且這些毒性損傷改變?cè)贛T-／-小鼠中更為嚴(yán)重，提示MT-／-小鼠對(duì)DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡更為敏感。由此表明，MT在基礎(chǔ)水平就能抑制DOX引起的心肌細(xì)胞線粒體損傷，抑制DOX活化心肌Caspase-3而