SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本文通過建立阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性大鼠模型和阿霉素刺激體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞，同時(shí)給予SalB進(jìn)行干預(yù)，探討SalB改善阿霉素心臟毒性的作用以及分子機(jī)制，為臨床蒽環(huán)類藥物化療方案中心臟保護(hù)劑的運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)研究：
　　（一）模型的制備與判定
　　本實(shí)驗(yàn)采用以劑量遞增(1，1.5，2，2.5，3mg·kg-1)的方式，按照體重以1ml·100g-1每隔2天腹腔注射阿霉素，復(fù)制大鼠心衰模型

2、。4周后觀察到大鼠萎靡不振、活動(dòng)、進(jìn)食減少、呼吸加快、體溫下降、體重明顯減輕，且左心室內(nèi)壓降低至正常值的2/3，符合Bishop關(guān)于慢性心衰動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)，表明阿霉素方法復(fù)制心臟毒性模型成功。
　?。ǘ㏒alB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心臟毒性大鼠的保護(hù)作用以及機(jī)制研究
　　1.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響。本實(shí)驗(yàn)采用MAP生理記錄儀檢測(cè)大鼠左心室收縮壓LVSP，左心室舒張壓LVDP，左心室最大上升速率(+)dp/dt

3、，左心室最大下降速率(-)dp/dt，動(dòng)脈收縮壓ASP以及心率HR。結(jié)果顯示:與模型組相比，隨著給藥持續(xù)時(shí)間的增加，SalB各組呈劑量依賴性地升高大鼠LVSP、(+)dp/dt、HR和ASP，降低大鼠(-)dp/dt、LVDP等參數(shù)(P＜0.05)。表明SalB能夠緩解阿霉素引起心功能的降低。
　　2.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠組織形態(tài)方面的影響。制作病理心肌組織切片，進(jìn)行HE、Masson和8-OHdG免疫組化染色，觀察Sa

4、lB對(duì)膠原纖維、間質(zhì)形態(tài)以及炎癥浸潤(rùn)的影響。病理結(jié)果顯示:SalB能明顯減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的病變、減少炎癥浸潤(rùn)，降低膠原纖維的含量和8-OHdG的表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用(P＜0.05)。
　　3.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠NO、TNOS、TSH、SOD、MDA的影響。采用試劑盒檢測(cè)大鼠血清和心臟組織中丙二醛(MDA)、超氧岐化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、總一氧化氮合成酶(TNOS)以及總巰基(TSH)含

5、量變化。結(jié)果顯示:與模型組相比，隨著給藥持續(xù)時(shí)間的增加，不同劑量的SalB能明顯降低模型組大鼠心臟組織中MDA的含量，降低血清TNOS活性，抑制NO的生成，減少自由基對(duì)心臟的損傷。SalB還能增強(qiáng)TSH、SOD的活性，增加機(jī)體清除自由基的能力，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用(P＜0.01)。
　　4.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠炎癥因子TNF-α、IL-6的影響。采用ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α，IL-6的活性，觀察不同劑量的Sal

6、B對(duì)大鼠血清中TNF-α，IL-6的活性影響。結(jié)果顯示:SalB25.4和12.5mg·kg-1劑量組能顯著降低阿霉素誘導(dǎo)的TNF-α的生成(P＜0.05，P＜0.01)，同時(shí)不同劑量的SalB均可抑制大鼠血清中IL-6的活性(P＜0.01)。以上表明SalB能顯著抑制炎癥因子的生成，從而減少炎癥誘發(fā)的心肌損傷，起到對(duì)心臟的保護(hù)作用。
　　5.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠NF-kB的影響。采用Western Blot檢測(cè)心臟組織

7、NF-kB蛋白表達(dá)，觀察不同劑量的SalB對(duì)NF-kB蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組阿霉素使大鼠心肌細(xì)胞中NF-kB大量表達(dá)(P＜0.01)。SalB不同劑量組明顯降低心臟組織中NF-kB表達(dá)，抑制了一系列促凋亡基因的活化和信號(hào)通路，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率(P＜0.01)。
　　6.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠SIRT1及下游蛋白表達(dá)的影響。采用Western Blot方法檢測(cè)SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性大鼠心臟組織中SIR

8、T1、P-FOXO3a、MnSOD蛋白表達(dá)的影響。Western Blot結(jié)果顯示:模型組阿霉素下調(diào)心肌細(xì)胞的SIRT1，P-FOXO3a，MnSOD的表達(dá)，SalB不同劑量組顯著增加SIRT1，P-FOXO3a，MnSOD的蛋白表達(dá)(P＜0.01)。提示，SalB降低阿霉素心臟毒性與SIRT1蛋白有關(guān)。
　　（三）SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的作用機(jī)理研究
　　1.MTT篩選最佳阿霉素和SalB濃度。采用MTT細(xì)

9、胞增殖與毒性試劑盒篩選最佳阿霉素和SalB的濃度。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同濃度的阿霉素對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活性呈現(xiàn)抑制作用。2umol·L-1濃度的阿霉素刺激12h后，可顯著抑制H9C2心肌細(xì)胞的活力(P＜0.01)。而SalB各給藥組對(duì)H9C2心肌細(xì)胞均有不同程度的增殖作用，呈一定的量效關(guān)系，60umol·L-1濃度的SalB刺激12h后細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)(P＜0.01)。
　　2.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞氯化損傷的保

10、護(hù)作用。以H9C2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用阿霉素和煙酰胺進(jìn)行干預(yù)，采用倒置顯微鏡觀察SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞中線粒體膜電位大小;采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化。結(jié)果顯示SalB能顯著改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的異常變化，降低細(xì)胞的死亡率(P＜0.01)，減少心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加(P＜0.01)，升高阿霉素導(dǎo)致的線粒體膜電位的降低(P＜0.01)。煙酰胺能抑制S

11、alB對(duì)其的保護(hù)作用(P＜0.01)。
　　3.SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞毒性中的氯化應(yīng)激標(biāo)志物SIRT1蛋白表達(dá)影響。采用Western Blot方法檢測(cè)SalB對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞毒性的氧化應(yīng)激標(biāo)志物SIRT1蛋白、FOXO3a磷酸化蛋白、MnSOD蛋白的表達(dá)水平。Western Blot結(jié)果顯示:SalB能顯著上調(diào)SIRT1蛋白水平的表達(dá)(P＜0.01)、顯著增加FOXO3a的蛋白磷酸化水平(P＜0.01