抗菌肽MET在畢赤酵母中的表達及其與抗生素的體外聯(lián)合抑菌作用.pdf

1、抗生素濫用導致細菌對抗生素產生耐藥性，對醫(yī)療和畜牧業(yè)產生較大影響，開發(fā)新模式的抗菌藥物成為急需要解決的問題?？咕哪軌蜃饔糜诩毦募毎な蛊浒l(fā)生裂解，導致細胞死亡，不容易產生耐藥性，而且具有廣譜抗菌活性，可以成為抗生素的理想替代品。但已知抗菌肽大多數(shù)是天然分離的，不僅含量小，成本極高，而且有些天然抗菌肽對細胞有一定毒性，不利于抗菌肽在臨床和畜牧業(yè)的應用。很多學者致力于研究人工合成抗菌肽、提高其生物活性。本試驗將人工設計合成的抗菌肽 ME

2、T在畢赤酵母中進行表達，并分離純化對其抗菌活性和與抗生素的聯(lián)合使用做了研究。
　　根據(jù)Genbank中抗菌肽MET的氨基酸序列，人工設計合成一段可編碼表達MET的核酸序列。將MET基因序列克隆到真核表達載體pPICZa-A中，并對克隆結果進行酶切鑒定來驗證，然后將重組載體電擊轉化入畢赤酵母GS-115中，提取陽性重組子的基因組做PCR，結果表明轉化成功。篩選陽性酵母重組子，定期添加甲醇發(fā)酵培養(yǎng)，提取發(fā)酵上清通過SDS-PAGE電泳

3、對條帶進行分析。電泳結果表明，目的抗菌肽得到成功表達，而且蛋白分子量的大小與預期相符。用考馬斯亮藍法測定抗菌肽MET的表達量約為132μg/mL。
　　測定抗菌肽MET和抗生素(Ampicillin、Cephalexin、ciprofloxacin、Doxycycline hyclate、Florfenicol、Polymyxin B、Roxithromycin、Streptomycin sulfate)的最小抑菌濃度(MIC)。

4、分析抗菌肽MET與抗生素聯(lián)合使用時的分級抑制濃度指數(shù)(FIC)，研究抗兩者之間的聯(lián)合藥效:(1)抗菌肽MET與鹽酸強力霉素結合時對致病性大腸桿菌的抑菌效果表現(xiàn)為協(xié)同作用；(2)抗菌肽MET與多粘菌素 B結合時對S.aureus的抑菌效果表現(xiàn)出協(xié)同作用，與羅紅霉素結合時對S.aureus的抑菌效果表現(xiàn)出增強作用；(3)抗菌肽MET與羅紅霉素結合時對豬沙門氏菌的抑菌效果表現(xiàn)出協(xié)同作用，與多粘菌素B結合時對豬沙門氏菌的抑菌效果表現(xiàn)出增強作用；

5、(4)抗菌肽MET與氨芐青霉素、羅紅霉素、硫酸鏈霉素聯(lián)合使用對副溶血性弧菌的抑菌效果表現(xiàn)為協(xié)同關系，與頭孢美唑、丙環(huán)沙星、鹽酸強力霉素、氟苯尼考、多粘菌素B聯(lián)合使用對副溶血性弧菌表現(xiàn)出增強作用；(5)抗菌肽MET與氨芐青霉素、多粘菌素 B聯(lián)合作用于痢疾志賀氏菌表現(xiàn)出增強作用；(6)抗菌肽 MET與氟苯尼考、多粘菌素B聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，與氨芐青霉素、頭孢美唑、硫酸鏈霉素聯(lián)合作用于嗜水氣單胞菌表現(xiàn)出增強作用；(7)抗菌肽