蛔蟲抗菌肽cecropin P1在畢赤酵母中的表達及生物學活性檢測.pdf

1、許多傳統(tǒng)的抗生素具有毒副作用且能夠誘導耐藥菌株的產(chǎn)生，甚至出現(xiàn)了能夠耐受幾乎所有抗生素的“超級細菌”，致使一些抗生索療效降低，甚至無效。世界衛(wèi)生組織在1994年就已宣布，抗生素的使用將成為全世界醫(yī)療衛(wèi)生的一個嚴重問題[l]。細菌耐藥性的問題推動了人們尋求新型抗菌藥物的決心。
　　 抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是由生物體基因編碼的一類具有抗菌活性的小分子多肽，是宿主先天性非特異性防御系統(tǒng)的重要組

2、分[2，3]，具有非特異性抗細菌、真菌、病毒等病原體作用[4,5]，還有研究表明，抗菌肽無致畸作用且不易發(fā)生蓄積中毒。因此，抗菌肽成為最具開發(fā)前景的抗生素替代品。
　　 蛔蟲寄生在動物和人體富含細菌的腸道內(nèi)，提示蛔蟲有某種抗菌機制，近年來國外學者從其體內(nèi)分離到cecropin類抗菌肽[2]，顯示有廣譜的殺菌作用，抗菌譜主要包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，對病毒、腫瘤細胞、原蟲、真菌也有一定的抑制作用。而且耐高溫，100℃加熱仍能

3、保持一定的活性。Lee等首先從豬小腸分離得到cecropin P1，含31個氨基酸，后來證實是由蛔蟲(Ascaris suum)在抵抗微生物時分泌的。Pillai等(2005)利用cDNA差異顯示技術對蛔蟲(Ascarissuum)cDNA研究，測定了編碼cecropin P1的基因序列，同時又發(fā)現(xiàn)了3個新的蛔蟲抗菌肽基因，分別命名為cecropins P2、P3和P4，化學合成這些短肽，發(fā)現(xiàn)其有廣譜抗菌活性，其中尤以cecropin

4、Pl殺菌活性最強。
　　 由于蛔蟲是動物和人體內(nèi)的寄生蟲，獲得大量的抗菌肽十分的困難，基因工程領域的飛速發(fā)展，為大量獲得蛔蟲抗菌肽提供了兩全其美的方案。由于抗菌肽對工程菌有毒性，必須采用融合表達和酵母表達策略，近年來國內(nèi)外對此研究取得了可喜的進展，多種來源的抗菌肽基因在大腸桿菌和酵母菌中表達成功，表達產(chǎn)物具有生物學活性，說明本研究路線是可行的。在本文中，我們期望通過分析以蛔蟲為主的抗菌肽的分子結構，設計、合成一段多肽并使其在畢赤

5、酵母表達系統(tǒng)中分泌表達，期望能夠獲得具有抗菌活性的轉(zhuǎn)基因酵母菌株，獲得大量有活性抗菌肽用于研究應用當中.初步探索蛔蟲cecropin P1生物活性，為日后獲得抗菌活性更高、抗菌譜更廣的抗菌肽打下一定的基礎。
　　 目的應用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術研究蛔蟲抗菌肽cecropinP1及其體內(nèi)外抗菌活性，為重組抗菌肽cecropinP1的工程化生產(chǎn)以及公共衛(wèi)生健康服務奠定基礎。本研究通過基因工程獲得cecropin P1抗菌肽希望給社

6、會帶來經(jīng)濟效益。
　　 方法在畢赤酵母表達系統(tǒng)中表達蛔蟲抗菌肽cecropin P1并檢測其生物活性，根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，人工設計并合成3條cecropin P1基因寡核苷酸片段，通過PCR擴增得到cecropin P1基因，構建重組載體pMD18-T-cecPl。雙酶切pMD18-T-cecP1，將cecropin P1基因克隆到載體pPICZα-A信號序列α-因子之后，構建酵母分泌表達載體pPICZα-A-cecPI

7、，用Sac I將其線性化后，采用電穿孔法進行轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，采用Zeocin抗性篩選陽性菌株并進行誘導表達，獲得酵母分泌表達載體pPICZα-A-cecP1。獲得的表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳、應用紙片法抑菌實驗初步測定表達產(chǎn)物的抑菌活性，進一步測定表達產(chǎn)物的生物學活性。
　　 結果 SDS-PAGE證實pPICZα-A-cecPl/X-33甲醇誘導產(chǎn)物的分子質(zhì)量單位為6.3ku，表達產(chǎn)物對大腸埃希菌DH5α的生長有抑

8、制作用。初步抑菌活性測定顯示其對大腸桿菌DH5α、嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50222和志賀氏菌SDCDC563有明顯的抑制作用，但對銅綠假單胞菌27853沒有抑菌圈的產(chǎn)生。誘導表達上清液對骨髓瘤細胞SP2/O有明顯的抑制生長作用，抑制率最大為74-845％，IC50為87.181μg/ml。對杜氏利什曼原蟲也有明顯的抑制生長作用抑制率最大為85.381％，IC5o為37.333μg/ml。
　　 結論成