HMGB1在嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇大鼠腸道ICAM-1表達(dá)中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇后，腸道組織的缺血缺氧：進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂、損傷及最終死亡。而長時(shí)間低動(dòng)力循環(huán)，使循環(huán)淤滯和微血栓的形成從而誘發(fā)患者血小板的聚集和活化，在缺血部位聚集、趨化和浸潤也是由預(yù)激白細(xì)胞導(dǎo)致的，進(jìn)而造成毛細(xì)血管通透性增高，從而引發(fā)腸道組織間質(zhì)水腫。進(jìn)而損傷腸道粘膜，破壞腸道屏障，致使細(xì)菌和毒素容易移位，進(jìn)而導(dǎo)致全身感染即全身炎癥反應(yīng)綜合癥（systemic in-flammatory response s

2、yndrome,SIRS）乃至多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。所以腸損傷是導(dǎo)致燒傷患者死亡的一個(gè)重要因素。
　　細(xì)胞間粘附分子1（intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1）又名CD54，免疫球蛋白超家族中的成員，介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的黏附分子，是單鏈跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)由胞外區(qū)、疏水的跨膜區(qū)及較短的胞質(zhì)區(qū)組成，是一種重要炎癥

3、介質(zhì)。CAM-1在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)游走、維持，炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)，血栓形成、和對(duì)腫瘤的治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)最強(qiáng)、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞也有表達(dá)。在腸組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中，ICAM-1表達(dá)可破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致血管通透性增加及腸水腫的形成。粘附分子上ICAM-1通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或與基質(zhì)相互作用，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在嚴(yán)重?zé)齻缙谂K器損害發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
　　高遷移

4、率族蛋白B1(high mobility group box1protein,HMGB1)是35年前發(fā)現(xiàn)的一種與DNA結(jié)合的蛋白，普遍存在于多種動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，如胸腺，淋巴細(xì)胞等。HMGB1作為核蛋白的功能，參與了細(xì)胞核小體的從組，修復(fù)及增值等。HMGB1是一種內(nèi)源性免疫佐劑也是晚期嚴(yán)重介質(zhì)，各種炎癥性疾病的發(fā)展起到重要作用，如燒傷，急重癥胰腺炎，腫瘤等。但是關(guān)于HMGB1在嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇大鼠腸道ICAM-1的表達(dá)中作用及初步機(jī)制尚不清楚

5、。
　　本課題采用大鼠30％ TBSAⅢ度燒傷延遲復(fù)蘇動(dòng)物模型，觀察嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇所致急性腸損傷時(shí)腸組織中HMGB1的動(dòng)態(tài)變化，并檢測腸組織細(xì)胞間粘附分子（I CAM-1）表達(dá)及p38MAPK活性等的變化，探討嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇后腸損傷的發(fā)生機(jī)制與HMGB1的關(guān)系。以了解HMGB1在嚴(yán)重?zé)齻笫竽c道ICAM-1的表達(dá)中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)燒傷導(dǎo)致的腸損傷的發(fā)生提供新的思路及方法。
　　目的：
　　探討HMGB1在

6、嚴(yán)重?zé)齻舆t復(fù)蘇大鼠腸道ICAM-1表達(dá)中的初步機(jī)制。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)的Sprague–Dawley雌性大鼠56只，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重在200～250g之間，將購買的大鼠在常溫下飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為N組（Normal，正常對(duì)照組，8只）、B組(Burn，燒傷延遲復(fù)蘇24只）和S組（Sodium butyrate，燒傷延遲復(fù)蘇+正丁酸鈉，24只）。開始實(shí)驗(yàn)后，給大鼠腹腔內(nèi)注射由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心配制的3

7、%戊巴比妥鈉(30mg/ kg)麻醉，去除大鼠背部毛發(fā)，用恒溫儀將水設(shè)置到98℃，將B組和S組大鼠背部靜置98℃熱水中12s后快速擦干，以免燙傷進(jìn)一步加重。結(jié)果造成大鼠背部30% TBSAⅢ度燙傷（后經(jīng)病理證實(shí)）。B組大鼠分別在傷后6h、12h、36h三個(gè)時(shí)間段，用乳酸林格氏液2ml·/(kg.TBSA)，腹腔注射進(jìn)行燒傷后液體的復(fù)蘇。S組使用正丁酸鈉的劑量為400mg/kg，首先根據(jù)每只大鼠的重量，計(jì)算出每只大鼠應(yīng)該使用的正丁酸鈉劑量

8、，然后將正丁酸鈉用乳酸林格氏液稀釋成1:150，腹腔注射進(jìn)行液體復(fù)蘇，并以同樣的時(shí)間點(diǎn)和方式給大鼠含等量正丁酸鈉的乳酸林格氏液，進(jìn)行休克的復(fù)蘇。所有燒傷后大鼠分別12h、24h和48h經(jīng)心臟取血后處死，后將大鼠放在固定板上，取出大鼠腸組織，用Western blot及免疫組化的方法檢測腸組織中HMGB1，ICAM-1的表達(dá)變化規(guī)律及轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)p38MAPK的活化情況。N組大鼠，進(jìn)行相同的麻醉，用室溫水浴模擬燙傷過程不進(jìn)行液體復(fù)蘇，但行相同

9、的指標(biāo)檢測。
　　結(jié)果：
　　1.燒傷延遲復(fù)蘇組大鼠隨病程的進(jìn)展，腸組織中HMGB1的表達(dá)逐漸增高，在傷后12h，24h和48h均顯著高于正常對(duì)照組。而燒傷延遲復(fù)蘇+正丁酸鈉組在燙傷后每個(gè)時(shí)間相表達(dá)均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的燒傷延遲復(fù)蘇組。
　　2.正常對(duì)照組腸組織上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有少量染色呈棕黃色，表示ICAM-1的表達(dá)呈輕度弱陽性。而燒傷延遲復(fù)蘇組血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腸組織上皮細(xì)胞表面有明顯的棕黃色顆粒，說明I

10、CAM-1呈強(qiáng)陽性。燒傷延遲復(fù)蘇+正丁酸鈉組血管內(nèi)皮細(xì)胞及腸組織上皮細(xì)胞表面可見少量的棕黃色顆粒，但較燒傷延遲復(fù)蘇組明顯減少。
　　3.用Westernblot方法檢測腸道p38MAPK的活性，p38MAPK的活性以p-p38/p38的灰度值比表示，并將正常對(duì)照組腸p38MAPK的活性設(shè)為1，燒傷延遲復(fù)蘇組24h，p38MAPK的活性明顯升高，為2.17，經(jīng)HMGB1抑制劑正丁酸鈉處理后，燒傷延遲復(fù)蘇+正丁酸鈉治療組24h大鼠腸道

11、p38MAPK活性較燒傷延遲復(fù)蘇組24h明顯降低，為1.03。
　　4.免疫組化的方法檢測腸組織p38MAPK的表達(dá)，在正常對(duì)照組大鼠的腸組織有散在的陽性蛋白顆粒，而嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇組傷后24h的腸組織的上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞有大量的p38MAPK陽性蛋白顆粒，在燒傷延遲復(fù)蘇＋正丁酸鈉24h組，免疫組化法檢測腸組織上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性蛋白顆粒明顯減少。
　　結(jié)論：
　　大鼠30%TBSAⅢ°燒傷延遲腸損傷發(fā)生時(shí)，