HMGB1在大鼠頸動脈球囊擴(kuò)張后再狹窄中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心血管系統(tǒng)疾病中最常見的疾病，也是血管疾病引起死亡的最主要原因。以AS為病理基礎(chǔ)的心腦和外周血管疾病的發(fā)病率和病死率逐年增高。AS是動脈硬化閉塞癥(Arteriosclerosis obliterans，ASO)最常見的病因，ASO最常見的發(fā)病部位為四肢的大、中動脈，病情嚴(yán)重時可造成肢體潰瘍及壞疽。經(jīng)皮血管腔內(nèi)擴(kuò)張成形術(shù)(Percutaneous translumi

2、nal angioplasty，PTA)及支架植入等介入治療是近年來迅速發(fā)展起來的治療動脈硬化閉塞癥的主要方法，因其對患者創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少，收效快，操作較簡便等原因，目前已逐步取代手術(shù)治療，但術(shù)后易發(fā)生血管再狹窄(Restenosis，RS)，是目前影響介入治療遠(yuǎn)期效果的最主要因素。目前的研究發(fā)現(xiàn)造成RS發(fā)生原因復(fù)雜，其具體機(jī)制尚不明確，其發(fā)病機(jī)制是RS研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究為了探討HMGB1與頸動脈球囊擴(kuò)張后再狹窄的關(guān)系及作用機(jī)制，

3、首先需要建立一個穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、可行且與人類動脈球囊擴(kuò)張后再狹窄近似的理想的動物模型，然后在動物模型中展開關(guān)于RS發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究。
　　高遷移率族蛋白(High mobility group protein，HMG)是一類在聚丙烯酰胺凝膠中能快速遷移的蛋白，其中高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1protein，HMGB1)是廣泛分布于真核生物細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合非組蛋白，胞核中的HMGB1主要與D

4、NA發(fā)生非特異性結(jié)合，發(fā)揮骨架蛋白的作用;而胞外的HMGB1最重要的作用是通過其受體誘導(dǎo)并加重局部炎癥。血管腔內(nèi)成形術(shù)后再閉塞的因素很多，RS是其中的一個主要因素。球囊擴(kuò)張損傷術(shù)后血管壁炎癥是RS的主要病理特征，這一過程存在于RS的各期，引起大量炎癥細(xì)胞和炎癥因子浸潤。HMGB1能誘導(dǎo)并加重局部炎癥，而炎癥是RS早期及中期的最主要病理特征，HMGB1水平是否與球囊擴(kuò)張后再狹窄有關(guān)？我們擬通過檢測球囊擴(kuò)張后再狹窄模型中HMGB1水平，探討

5、HMGB1是否能通過促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)，加重血管局部炎癥，促進(jìn)RS的發(fā)生。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是茶葉中含量最多的一類多元酚類化合物，有很強(qiáng)的抗炎作用，已有研究表明其能抑制HMGB1在巨噬細(xì)胞表面聚集，并能減輕誘導(dǎo)的炎癥。然而EGCG是否能夠通過抑制HMGB1誘導(dǎo)的炎癥減輕球囊擴(kuò)張后再狹窄，目前尚不清楚，本研究中我們探討了EGCG對HMGB1表達(dá)水平及球囊擴(kuò)張后

6、再狹窄的影響。細(xì)胞外的HMGB1只有與細(xì)胞表面特異性胞膜受體結(jié)合才能將胞外信號傳遞至胞膜內(nèi)，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)。RAGE、TRL4是HMGB1最主要的受體，球囊擴(kuò)張后再狹窄模型受損血管組織細(xì)胞表面RAGE、TLR4表達(dá)水平呈現(xiàn)出什么樣的變化，是否與HMGB1和RS病情輕重存在相關(guān)性，是我們要研究的另一問題。
　　方法:
　　首先我們擬用球囊損傷法構(gòu)建大鼠頸動脈球囊損傷再狹窄模型。將健康SD大鼠隨機(jī)分為5組:對照組（假手術(shù)組）、球

7、囊擴(kuò)張組（手術(shù)組）、EGCG(1mg/kg)組、EGCG(2mg/kg)組、EGCG（4mg/kg）組。手術(shù)組大鼠行球囊擴(kuò)張術(shù);EGCG組大鼠行球囊擴(kuò)張，術(shù)后每天經(jīng)腹腔注射相應(yīng)濃度的EGCG;對照組大鼠僅行假手術(shù)。對各組大鼠頸動脈組織進(jìn)行病理分析，觀察血管形態(tài)及新生內(nèi)膜形成情況，內(nèi)膜、管腔、中膜面積和血管狹窄度;定量PCR和western blot檢測HMGB1、RAGE、TLR4、NF-κb mRNA和蛋白的表達(dá)，ELISA法檢測各組

8、大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，細(xì)胞間黏附分子(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)等炎癥因子的表達(dá)水平;商品化試劑盒檢測各組

9、大鼠血管組織中的丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量和活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成情況;電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA，electrophoretic mobility shift assay)檢測核轉(zhuǎn)錄因子kappa b(NF-κb)的活性。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠行球囊擴(kuò)張術(shù)后3天，血管壁內(nèi)皮大量剝脫，有貼血管壁的血栓形成，出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤。隨著時間推移，有越來越多的炎

10、癥細(xì)胞在損傷動脈處浸潤，并伴大量炎性細(xì)胞因子分泌，血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells，VSMC)異常增殖、排列無序，逐漸由中膜層向內(nèi)膜下轉(zhuǎn)移。術(shù)后28天，動脈內(nèi)膜層嚴(yán)重狹窄，內(nèi)膜下細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量沉積，并有大量泡沫細(xì)胞。
　　2.管腔面積:術(shù)后4周動脈管腔較術(shù)后2周后管腔面積顯著減少(p＜0.05)。術(shù)后7天的新內(nèi)膜面積手術(shù)組明顯大于對照組(p

11、＜0.05)，且隨時間逐漸延長新內(nèi)膜面積逐漸增大(P＜0.05)。內(nèi)膜面積:術(shù)后7天新生內(nèi)膜面積顯著高于對照組(p＜0.05)，術(shù)后28天大鼠的新內(nèi)膜面積與術(shù)后14天大鼠的內(nèi)膜面積顯著不同(p＜0.05)。中膜面積:術(shù)后0天和術(shù)后28天大鼠中膜面積無顯著差異(p＞0.05)。再狹窄主要由新生內(nèi)膜增厚引起，中膜層未見顯著增厚。
　　3.手術(shù)組大鼠頸動脈組織中HMGB1的基因和蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(p＜0.01)。不同EGCG

12、濃度處理大鼠頸動脈組織HMGB1表達(dá)水平均低于手術(shù)組，且隨著EGCG濃度升高，HMGB1表達(dá)表現(xiàn)出進(jìn)行性下降趨勢，呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
　　4.Westernblot和EMSA檢測結(jié)果顯示，球囊擴(kuò)張手術(shù)組大鼠頸動脈NF-κb表達(dá)量和活性均顯著高于假手術(shù)組，是假手術(shù)組的4.19倍(p＜0.01)。用不同濃度EGCG處理的手術(shù)組大鼠頸動脈NF-κb表達(dá)量和活性隨著EGCG濃度升高逐漸降低。
　　5.球囊擴(kuò)張組大鼠頸動脈中IL-1

13、β、IL-6、TNF-α的濃度分別為254.12，178.68，813.17pg/mgprot，均顯著高于假手術(shù)組的40.51、35.12、78.68pg/mgprot(p＜0.01)。不同濃度EGCG處理的大鼠頸動脈IL-1β、IL-6、TNF-α、IACM-1、CAM-1濃度均隨著EGCG濃度升高逐漸降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系，
　　6.球囊擴(kuò)張組大鼠頸動脈組織ROS含量顯著高于假手術(shù)組(p＜0.01)，EGCG處理后ROS降

14、低，且隨著EGCG濃度升高ROS呈逐漸降低趨勢。球囊擴(kuò)張組大鼠頸動脈組織MDA濃度為1.89nmol/mgprot，顯著高于假手術(shù)組0.66nmol/mgprot(p＜0.01)。MDA濃度表現(xiàn)出隨著EGCG用量增加逐漸降低的變化趨勢，
　　7.手術(shù)組大鼠頸動脈組織中RAGE、TLR4的基因和蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(p＜0.01)。不同EGCG濃度處理大鼠頸動脈組織RAGE、TLR4表達(dá)水平均低于手術(shù)組，且隨著EGCG濃度升