噬菌體展示肽庫篩選成人骨細胞特異性結合多肽的實驗研究.pdf

1、以純化的人顱骨成骨細胞為陽性靶細胞,從噬菌體展示十二肽庫中篩選出能夠與之特異性結合的多肽,為鈦種植體表面的生物化修飾提供新的策略和研究方向。
　　第一部分:噬菌體展示十二肽庫篩選人成骨細胞特異性多肽的實驗研究
　　以人顱骨成骨細胞作為靶細胞,對噬菌體展示十二肽庫進行全細胞篩選,洗滌后將獲得的細胞洗脫液和細胞裂解液分別培養(yǎng)計數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計數(shù)平板中隨機挑選46個(洗脫、裂解各23個)分離良好的噬菌體克隆,以人牙齦成纖維細

2、胞為對照細胞進行細胞ELISA檢測、細胞免疫熒光等鑒定陽性噬菌體克隆并測序分析。
　　結果顯示:共得到22個與成骨細胞特異性結合力高于成纖維細胞2倍以上的陽性克隆,氨基酸序列具有同源性。洗脫、裂解液中獲得了共同的特異性結合多肽,比例相當,占有相近的結合優(yōu)勢,這也說明與成骨細胞具有高度親和力的噬菌體是通過其表面展示的短肽與細胞特異性結合,而能夠內(nèi)化入細胞胞漿內(nèi)的噬菌體也是通過這種受體介導的胞吞作用進行的。出現(xiàn)頻率最高的多肽氨基酸序列

3、為:MGWSWWPETWPM,對該多肽序列的氨基酸組成特點及其基本的生化特性進行分析。
　　第二部分:噬菌體展示十二肽庫全細胞差減篩選人成骨細胞特異性多肽的實驗研究
　　以人顱骨成骨細胞作為陽性靶細胞,人牙齦成纖維細胞為陰性吸附細胞,對噬菌體展示十二肽庫進行全細胞差減篩選,洗滌后將獲得細胞洗脫液培養(yǎng)計數(shù),經(jīng)四輪篩選后,從計數(shù)平板中隨機挑選30個噬菌體克隆,分別用人顱骨成骨細胞和人牙齦成纖維細胞進行細胞ELISA檢測、細胞免疫

4、熒光等鑒定陽性噬菌體克隆并測序分析。其中共得到18個與成骨細胞特異性結合力高于成纖維細胞2倍以上的陽性克隆,其中比值最高者為4.88,取該純化噬菌體樣品(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)進行細胞免疫熒光實驗。
　　結果顯示:表達該多肽(氨基酸序列為VLAVPWSEPGYL)的噬菌體克隆可大量聚集結合在人成骨細胞表面,在細胞內(nèi)部呈現(xiàn)點簇狀聚集而發(fā)出綠色熒光,成纖維細胞綠色熒光暗淡。對該多肽序列的氨基酸組成特點及其基本的生化特性