噬菌體展示技術(shù)體內(nèi)篩選人膀胱癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽.pdf

1、目的：
　　利用噬菌體展示技術(shù)通過體內(nèi)篩選的方法得到能夠和人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞特定結(jié)合起來的小分子多肽。
　　方法：
　　將人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)，制備膀胱癌荷瘤裸鼠模型。經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈將噬菌體展示環(huán)七肽庫注入其體內(nèi)，篩選可同膀胱移行細(xì)胞癌組織特異性結(jié)合的單克隆噬菌體。經(jīng)過三輪體內(nèi)篩選后，運用免疫組織化學(xué)法顯示噬菌體在體內(nèi)腫瘤及各組織的分布情況，同時隨機挑取三十個單克隆噬菌體，運用酶聯(lián)

2、免疫法觀察噬菌體對人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞親和力大小。將陽性表達(dá)的噬菌體DNA提取出來，并進行序列測定，推算出插入多肽的氨基酸序列，通過軟件庫進行同源性比對分析。多肽通過固相合成法合成，并標(biāo)記熒光素異硫氰酸成為熒光探針。MTT法檢測多肽及熒光探針對BIU87細(xì)胞的毒性。激光掃描共焦顯微鏡術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)鑒定熒光探針對人膀胱移行細(xì)胞癌BIU87細(xì)胞的親和性。免疫熒光組織化學(xué)法鑒定熒光探針對膀胱腫瘤患者病理組織的特異性。
　　結(jié)果

3、：
　　1環(huán)七肽庫經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)，噬菌體滴度及組化染色結(jié)果顯示：隨著篩選逐輪進行，噬菌體在荷瘤裸鼠的膀胱腫瘤組織中出現(xiàn)明顯富集，當(dāng)篩選到第三輪結(jié)束時，回收率是首輪篩選結(jié)束后的4.334×102倍；肝臟與腎臟組織因血管豐富、代謝速度快等特點，可以非特異的吸附大量噬菌體肽庫，而膀胱、肺與肌肉組織只有少量噬菌體肽庫結(jié)合。
　　2體內(nèi)篩選三輪結(jié)束后，隨機挑取三十個藍(lán)色單克隆噬菌體，利用酶免法初步檢測單克隆噬菌體對BIU8

4、7細(xì)胞的親和力，結(jié)果顯示：共有二十四個單克隆噬菌體親和力≥2，是陽性表達(dá)的噬菌體克隆，陽性率達(dá)80％，其中有十個單克隆噬菌體親和力≥5，將其擴增并對DNA進行提取、測序、翻譯，共獲得三條序列：CSSPIGRHC（8/10）、CTMSNLKGC（1/10）及 CNNVLSQMC(1/10)。將重復(fù)率最高的多肽序列 CSSPIGRHC命名為 NYZL1，運用 ExPASy/ProtParam、NCBI/BLAST等數(shù)據(jù)庫分析，上述序列之間沒

5、有同源性，NYZL1與目前所知的基因和蛋白沒有發(fā)現(xiàn)同源性，且國內(nèi)外文獻均沒有相關(guān)報道。
　　3固相合成NYZL1及FITC-NYZL1，并與BIU87細(xì)胞孵育，PBS作空白對照，觀察多肽及熒光探針對BIU87細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明多肽及熒光探針在～100μ mol/L濃度范圍內(nèi)孵育細(xì)胞24小時，對BIU87細(xì)胞的增殖及活性無影響，同時表明熒光標(biāo)記物FITC不會破壞多肽NYZL1的分子構(gòu)象。
　　4將FITC-NYZL1及FIT

6、C-svNYZL1與BIU87細(xì)胞孵育，PBS作空白對照，使用共聚焦顯微鏡鏡下觀察其結(jié)合情況，結(jié)果表明 FITC-NYZL1在 BIU87細(xì)胞上有高富集熒光亮點，且均勻結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中，表明 FITC-NYZL1與BIU87細(xì)胞具有親和力和特異性。
　　5將FITC-NYZL1及FITC-svNYZL1與BIU87細(xì)胞孵育后流式細(xì)胞儀觀察，結(jié)果顯示 FITC-NYZL1與 BIU87細(xì)胞結(jié)合的熒光強度值為53.1925±1.

7、35， FITC-svNYZL1與BIU87細(xì)胞結(jié)合的熒光強度值為15.17±1.06，PBS空白對照熒光強度值為6.67±0.10，P<0.01，差異在統(tǒng)計學(xué)中有意義，表明 FITC-NYZL1與BIU87細(xì)胞具有親和力和特異性。
　　6將 FITC-NYZL1、FITC-svNYZL1分別孵育膀胱腫瘤患者病理組織及癌旁正常膀胱組織石蠟切片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在膀胱腫瘤組織切片中， FITC-NYZL1組熒光富集度高，平均

8、熒光強度為1974.04±407.57，F(xiàn)ITV-svNYZL1組熒光很弱，平均熒光強度為140.07±178.23，而在癌旁正常膀胱組織切片中，兩組熒光顯示都很弱，平均熒光強度值分別為349.27±46.29、155.79±143.37，表明FITC-NYZL1能特異性的結(jié)合于膀胱腫瘤組織，且親和力高。
　　結(jié)論：
　　本次實驗快速有效的構(gòu)建了BIU87細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，通過體內(nèi)篩選獲得了能夠與膀胱腫瘤細(xì)胞特定結(jié)合的多肽