金欣口服液拮抗RSV入侵人胚肺成纖維細(xì)胞的抗病毒作用機(jī)制研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒是嬰幼兒急性下呼吸道感染最主要的病毒病原體，可以導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎等。目前RSV感染發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，尚缺乏有效的疫苗和治療手段防治RSV感染。中醫(yī)藥治療病毒性疾病有一定的優(yōu)勢(shì)。金欣口服液處方是汪受傳教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的結(jié)晶，由炙麻黃、苦杏仁、生石膏、黃芩、葶藶子、桑白皮、前胡、虎杖組成。開肺化痰解毒法是治療小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的有效方法，我們的前期臨床和基礎(chǔ)研究已經(jīng)證明其對(duì)RSV有很好的療效，

2、但機(jī)制不清。本研究從細(xì)胞間黏附分子-1、Ⅰ型干擾素-β以及細(xì)胞凋亡等方面，初步探討了金欣口服液干預(yù)RSV感染的可能機(jī)制。 第一部分金欣口服液對(duì)RSV感染人胚肺成纖維細(xì)胞的 ICAM-1mRNA和蛋白表達(dá)的研究 目的:探討會(huì)欣口服液對(duì)RSV感染人胚肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。 方法:體外建立RSV A型LONG株感染人胚肺成纖維細(xì)胞模型，設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對(duì)照組、

3、空白血清組、利巴韋林含藥血清組（簡(jiǎn)稱利巴韋林組）和金欣口服液含藥血清組（簡(jiǎn)稱金欣口服液組）。采用Real-Time PCR及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞ICAM-1mRNA及ICAM-1蛋白表達(dá)。 結(jié)果與正常細(xì)胞組（2-△△Ct值設(shè)為1）相比，RSV感染24小時(shí)后HELF細(xì)胞中ICAM-1mRNA的表達(dá)量上升為2.51倍（P<0.05）；空白血清組和利巴韋林組HELF細(xì)胞中ICAM-1mRNA的表達(dá)量回落，分別為0.54和0.67（P

4、>0.05）；而金欣口服液組HELF細(xì)胞中ICAM-1mRNA的表達(dá)量明顯回落，為正常細(xì)胞組的0.38（P<0.05）。 與正常細(xì)胞組各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1蛋白表達(dá)（0.48±0.04，0.51±0.03，0.52±0.01，0.58±0.13，0.58±0.04）比較，RSV感染12h、24h、48h、72h甚至在96h均增高（1.25±0.09，1.87±0.18，4.78±0.52，13±0.38，1.43±0.10）（P<

5、0.05），且在48h～72h分別達(dá)到（4.78±0.52，13±0.38）之多，96h后較72h的ICAM-1蛋白表達(dá)明顯下降為（1.43±0.10）（P<0.05）；而感染RSV后馬上用空白血清干預(yù)，HELF細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)量回落，12h～96h分別為（1.24±0.05，1.58±0.15，3.83±0.20，11.42±0.20，1.28±0.04）（P<0.05）；而感染RSV后馬上用含利巴韋林的血清干預(yù)，HELF細(xì)胞

6、中ICAM-1的表達(dá)量回落，12h～96h分別為（1.06±0.44，1.27±0.05，3.32±0.15，6.6±0.17，1±0.05）（P<0.05）：與空白血清組或利巴韋林組不同，感染RSV后馬上用含金欣口服液的血清干預(yù)，HELF細(xì)胞中ICAM-1蛋白表達(dá)量明顯回落，48h～96h分別下降到（2.78±0.13，6±0.17，0.77±0.04）（P<0.05）。 結(jié)論:①肺成纖維細(xì)胞和ICAM-1可能參與RSV肺炎的

7、發(fā)病機(jī)制；②RSV感染可使HELF細(xì)胞ICAM-1mRNA、ICAM-1表達(dá)顯著增高；⑨金欣口服液可調(diào)節(jié)ICAM-1mRNA、ICAM-1表達(dá)，緩解RSV感染后細(xì)胞的異常變化，這可能是其抗病毒作用的機(jī)制之一；④利巴韋林和空白血清對(duì)ICAM-1mRNA和ICAM-1蛋白表達(dá)也有一定的影響。 第二部分金欣口服液對(duì)RSV感染人胚肺成纖維細(xì)胞的干擾素-βmRNA和蛋白表達(dá)的研究 目的:探討金欣口服液對(duì)RSV感染人胚肺成纖維細(xì)胞是

8、否通過(guò)誘生干擾素-β（IFN-β）影響感染細(xì)胞增殖。 方法:體外建立RSV A型LONG株攻擊人胚肺成纖維細(xì)胞模型，設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對(duì)照組、空白血清組、利巴韋林組和金欣口服液組。采用Real-Time PCR及ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞IFN-βmRNA及IFN-β蛋白表達(dá)。 結(jié)果:與正常細(xì)胞組（2-△△Ct值為1.79）比較，RSV感染24小時(shí)后，HELF細(xì)胞中IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有明顯下降（2-△△Ct值

9、為1）（P>0.05）；空白血清組和利巴韋林組HELF細(xì)胞中IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.967和0.86）（P>0.05）；金欣口服液組HELF細(xì)胞中IFN-BmRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.57，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。 采用先加藥后感染RSV、先感染RSV后加藥、單用含藥血清干預(yù)3種加藥方式來(lái)分別觀察藥物是否對(duì)RSV有感染阻斷、增殖抑制或者直接誘生IFN-β實(shí)現(xiàn)抗病毒作用，各組IFN-β表達(dá)均為0pg/ml。

10、 結(jié)論:①RSV不刺激IFN-βmRNA和IFN-β的生成；②金欣口服液不誘導(dǎo)IFN-βmRNA的表達(dá)和IFN-β的生成，而金欣口服液可以抑制感染細(xì)胞的增殖作用，可能存在其他的非依賴于IFN-β的抗RSV途徑。 第三部分金欣口服液對(duì)RSV感染人胚肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、Bcl-2、Bax以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的研究 目的:探討細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax、細(xì)胞內(nèi)鈣離子等在RSV肺炎發(fā)病中的作用以及金欣口服液干

11、預(yù)RSV感染的可能機(jī)制。 方法:體外建立RSV A型LONG株攻擊體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞模型，設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對(duì)照組、空白血清組、利巴韋林組和金欣口服液組。采用Real-Time PCR法，觀察其對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和BaxmRNA表達(dá)變化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的總凋亡、早期凋亡以及凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響，并采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化。

12、 結(jié)果:RSV感染12、24hHELF細(xì)胞的總凋亡率（7.633±0.115，14.2±0.173）、早期凋亡率（2.2±0.346，4.267±0.231）均低于正常細(xì)胞組（25.667±0.577，17.13±0.115和12.73±0.289，8.267±0.231），且有顯著性差異（P<0.05）；空白血清組12、24h的總凋亡率（17.867±0.058，29.733±0.635）、早期凋亡率（7.93±0.058，22.

13、4±0.346）均高于病毒對(duì)照組，且有顯著性差異（P<0.05）；利巴韋林組12、24h總凋亡率（17.267±0.058，26.267±1.097）、早期凋亡率（9.37±0.231，19±0.866）均高于病毒對(duì)照組，且有顯著性差異（P<0.05）；金欣口服液組12、24h總凋亡率（12.2±0.17，15.733±0.115）、早期凋亡率（4.63±0.289，5.067+0.0577）均高于病毒對(duì)照組，且有顯著性差異（P<0.0

14、5）。但增加的程度不同，12、24h HELF細(xì)胞的總凋亡率和24h早期凋亡率依次排序是空白血清組（17.867±0.058，29.733±0.635，22.4±0.346）、利巴韋林組（17.267±0.058，26.267±1.097，19±0.866）、金欣口服液組（12.2±0.17，15.733±0.115，5.067±0.0577）（P<0.05）；12h早期凋亡率依次排序是利巴韋林組（9.37±0.231）、空白血清組（7