JNK信號(hào)通路在白介素-1β介導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖與活化中的作用.pdf

1、目的:
　　 1.研究C-Jun氨基末端激酶(JNK/SAPK)信號(hào)通路抑制劑SP600125對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖及磷酸化JNK蛋白表達(dá)的影響，明確其適宜的有效濃度，為后期研究作參考。
　　 2.觀察在白介素(IL)-1β不同的作用時(shí)間與濃度下肺成纖維細(xì)胞JNK磷酸化水平的變化，明確其量效關(guān)系，選擇適宜的有效作用時(shí)間和濃度，用于后期研究。
　　 3.探討JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在IL-1β介導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞增殖與活化中

2、的作用。
　　 方法:
　　 將MRC-5細(xì)胞株穩(wěn)定傳代、培養(yǎng)及同步化后，加入不同濃度的IL-1β(0、0.1 ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)刺激1h，或用IL-1β（10 ng/mL）刺激0、15 min、30 min、1h、2h、4h、8h、12h，使用免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)細(xì)胞JNK/SAPK磷酸化水平;加入不同濃度SP600125（0μmol/mL、1μmo

3、l/mL、5μmol/mL、10μmol/mL、20μmol/mL、40μmol/mL、50μmol/mL）處理30 min后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，確定適宜濃度范圍，采用WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞JNK/SAPK磷酸化水平;將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（未干預(yù)組）、IL-1β組(10 ng/mL IL-1β)、SP600125組(20μmol/mL SP600125+10 ng/mL IL-1β)，采用Western Blot檢測(cè)細(xì)

4、胞磷酸化JNK(P-JNK)蛋白和α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、纖維連接蛋白(FN)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中 NGF及白介素(IL)-6的水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.SP600125對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，小劑量JNK抑制劑SP600125不影響成纖維細(xì)胞的增殖，當(dāng)濃

5、度達(dá)到40μM時(shí)開始明顯抑制成纖維細(xì)胞的增殖。分別用1μM、5μM、10μM、20μM、40μM、50μM的SP600125處理30分鐘后，成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(0.93±0.18)％、(0.916±0.098)％、(0.860±0.130)％、(0.840±0.140)％、(13.910±2.0)％、(24.690±2.170)％。
　　 2.Western Blot檢測(cè)細(xì)胞JNK磷酸化水平及α-SMA蛋白表達(dá)IL-1

6、ββ促成纖維細(xì)胞JNK磷酸化的作用呈濃度依賴性增強(qiáng)，在0 ng/ml、0.1ng/ml、1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml IL-1β刺激下P-JNK IOD值分別為0.089±0.018、0.164±0.032、0.282±0.036、0.376±0.058、0.51±0.069,10 ng/mL時(shí)JNK磷酸化水平最高;用10ng/ml IL-1β刺激成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)作用下細(xì)胞P-JNK蛋白的表達(dá)存在動(dòng)

7、態(tài)變化，0min、15 min、30 min、1h、2h、4h、8h、12h的P-JNK IOD值分別為0.219±0.042、1.824±0.179、1.579±0.142、0.911±0.061,0.712±0.070,0.519±0.091,0.310±0.086,0.221±0.049。 JNK在15 min時(shí)出現(xiàn)磷酸化高峰，并維持至30 min，之后磷酸化水平逐漸減低，8h時(shí)恢復(fù)至正常水平，與0 min相比無顯著性差異(P＞0

8、.05);SP600125對(duì)成纖維細(xì)胞JNK磷酸化的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性增加，0μM、1μM、5μM、10μM、20μM SP600125作用下P-JNK IOD值分別為0.712±0.07、0.449±0.08、0.221±0.057、0.106±0.024、0.039±0.010，20μM組JNK磷酸化水平最低;20μmol/mL SP600125可抑制JNK磷酸化，其P-JNK IOD值為0.401±0.059，顯著低于10 n

9、g/ml IL-1β刺激下P-JNK IOD值(0.729±0.100)(P＜0.05)，而與對(duì)照組(0.375±0.051)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);SP600125組α-SMA蛋白表達(dá)(0.152±0.019)顯著低于IL-1β組(0.326±0.024)(P＜0.05)，高于對(duì)照組(0.119±0.033)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.RT-PCR檢測(cè)PAI-1、FN、NGF和α-SMA m

10、RNA相對(duì)表達(dá)量PAI-1、FN、NGF和α-SMA mRNA的表達(dá)呈明顯的一致性。IL-1β組[PAI-1mRNA(0.94±0.13)、FN mRNA(0.99±0.17)、NGF mRNA(0.181±0.035)和α-SMAmRNA(0.736±0.11)]均明顯高于對(duì)照組[PAI-1mRNA(0.37±0.10)、FNmRNA(0.46±0.019)、NGF mRNA(0.042±0.012)和α-SMAmRNA(0.194±

11、0.08)](P＜0.05)。SP600125組均有不同程度的升高，介于對(duì)照組和IL-1β組之間(P＜0.05)。
　　 4.ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中NGF及白介素(IL)-6的水平IL-1β組培養(yǎng)上清液中NGF水平(206.95±22.37)及IL-6水平(2073.16±175.78)均顯著高于對(duì)照組[NGF(48.75±12.76)、IL-6(103.46±15.4)](P＜0.05)，SP600125組介于對(duì)照組與IL