煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯X病毒的協(xié)生作用及二者侵染本氏煙的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬成員與馬鈴薯X病毒（Potato virus X, PVX）在生產(chǎn)中常常復(fù)合侵染植株產(chǎn)生協(xié)生作用，引起更為嚴(yán)重的癥狀。煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）是馬鈴薯Y病毒屬的一個確定種，能夠自然侵染煙草、馬鈴薯、番茄等茄科作物，在生產(chǎn)中的危害逐年加重。隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對植物轉(zhuǎn)錄本分析的研究逐漸成為熱點(diǎn)，但是應(yīng)用于研究病毒協(xié)生作用的分子機(jī)

2、制方面的報(bào)道還很少。本研究以實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的攜帶GFP的TVBMV侵染性克隆、將HC-Pro的CDN基序中D198突變?yōu)镵并將中間區(qū)域的IGN突變?yōu)镈EN而失去協(xié)生能力的弱毒突變體以及PVX侵染性克隆為基礎(chǔ)，研究TVBMV與PVX的協(xié)生作用，并利用RNA-Seq技術(shù)研究TVBMV野生型及弱毒突變體分別與PVX復(fù)合侵染本氏煙過程中差異表達(dá)的寄主基因，研究馬鈴薯Y病毒屬病毒與PVX協(xié)生作用影響的寄主代謝通路；利用小RNA測序技術(shù)鑒定侵染芝麻

3、的病毒種類，克隆獲得1個TVBMV芝麻分離物的全基因組序列并分析了其分子變異情況。具體結(jié)果如下：
　　從病害癥狀、病毒含量等方面研究了TVBMV與PVX的協(xié)生。本氏煙接種PVX后第10天，系統(tǒng)葉片表現(xiàn)花葉癥狀；TVBMV與PVX共同接種本氏煙，在系統(tǒng)葉片引起花葉及卷曲癥狀，導(dǎo)致植株生長遲緩；弱毒突變體與PVX共同接種本氏煙，僅在植株上部葉片引起輕微的花葉癥狀。TVBMV與PVX共同接種后第14天，本氏煙植株出現(xiàn)矮化和壞死，弱毒突變

4、體與PVX復(fù)合侵染僅引起與PVX相同的花葉癥狀。共同接種本氏煙后第20天，TVBMV與PVX協(xié)生加重了病害癥狀、顯著抑制煙草植株的生長，并造成了植株頂部葉片的壞死，而無協(xié)生作用的弱毒突變體與PVX復(fù)合侵染僅造成了與PVX單獨(dú)侵染相似的花葉癥狀。ELISA檢測結(jié)果表明，TVBMV與PVX復(fù)合侵染在接種后第6天TVBMV病毒積累量開始明顯升高，并且與單獨(dú)接種TVBMV的本氏煙中病毒積累量相當(dāng)；弱毒突變體與PVX復(fù)合侵染后TVBMV病毒積累量

5、遠(yuǎn)低于野生型TVBMV與PVX復(fù)合侵染的本氏煙，且病毒積累量一直維持在較低水平。
　　利用RNA-Seq技術(shù)研究了TVBMV野生型及弱毒突變體分別與PVX復(fù)合侵染過程中本氏煙的轉(zhuǎn)錄組變化情況。病毒在接種后第2天大量復(fù)制，接種后第2天的接種葉片及第10天的系統(tǒng)葉片中均含有大量的病毒RNA，clean reads能比到本氏煙參考基因組上的較少。GO富集分析顯示，TVBMV與PVX的復(fù)合侵染導(dǎo)致大量寄主基因發(fā)生異常表達(dá)，干擾了寄主的正常

6、代謝，影響了寄主蛋白和酶代謝相關(guān)基因、DNA復(fù)制相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因等，使寄主產(chǎn)生一系列的細(xì)胞組分、生物過程、分子功能的改變。與弱毒突變體與PVX的侵染相比，侵染前期TVBMV與PVX協(xié)生影響DNA復(fù)制通路17個基因上調(diào)表達(dá)，系統(tǒng)侵染后造成與細(xì)胞壁合成相關(guān)的33個基因和與光合作用相關(guān)的蛋白復(fù)合體及外周天線61個基因的下調(diào)表達(dá)以及RNA沉默途徑DCL2和RDR1基因的上調(diào)表達(dá)。KEGG分析表明，與弱毒突變體與PVX的侵染相比，TVB

7、MV與PVX協(xié)生，誘導(dǎo)核糖體合成相關(guān)基因的表達(dá)以幫助病毒蛋白合成；之后通過抑制光合作用相關(guān)代謝通路，抑制細(xì)胞壁合成相關(guān)酶的代謝通路，調(diào)節(jié)激素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起植株的花葉和壞死。同時，植物的SA信號途徑受到誘導(dǎo)，產(chǎn)生大量PR蛋白以防御病毒的侵染。
　　將從濟(jì)南章丘芝麻田中采集的表現(xiàn)黃綠花葉、細(xì)葉及皺縮的芝麻病株葉片進(jìn)行小RNA測序，檢測到西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、菜豆普通花葉病毒（

8、Bean common mosaic virus，BCMV）和煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）等三種馬鈴薯Y病毒屬病毒，其中TVBMV能夠自然侵染芝麻系首次報(bào)道，也是TVBMV能夠侵染除茄科以外作物的首次報(bào)道。
　　進(jìn)一步RT-PCR及血清學(xué)檢測證實(shí)了小RNA的測序結(jié)果。利用步移擴(kuò)增和5' RACE方法獲得了TVBMV-Zhangqiu分離物的全基因組序列，其全基因組序列為9596個核苷酸。TVBMV-Zhangqiu分離物與山東沂

9、源的YY分離物（JN630472）的核苷酸及氨基酸一致率最高，分別為97.89％和99.06%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TVBMV-Zhangqiu分離物聚類到來源于中國大陸的MC組；重組分析表明TVBMV-Zhangqiu分離物是SDYS1與YN分離物的潛在重組體，屬于MC組的組內(nèi)重組，其基因組的主要親本是SDYS1，8642 nt-9533 nt來源于YN；TVBMV-Zhangqiu與TVBMV-HN39接種芝麻的癥狀存在差異， Zha