侵染半夏的黃瓜花葉病毒研究.pdf

1、半夏是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，屬于天南星科半夏屬，為多年生草本植物。近三十年來(lái)，國(guó)際和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)對(duì)半夏的需求不斷增長(zhǎng)。半夏的人工栽培迎合了市場(chǎng)的需求，但是由于人工栽培時(shí)間短，栽培經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)少而不系統(tǒng)，過(guò)度依賴野生品種，導(dǎo)致其數(shù)量銳減，品種退化，加上半夏病蟲(chóng)病害的流行，給半夏生產(chǎn)帶來(lái)不利影響。當(dāng)野生半夏變?yōu)榧曳N，病蟲(chóng)害在大面積和高密度的人工栽培條件下極易發(fā)生，且常常由于病毒的侵染，引起種質(zhì)衰退。本文發(fā)現(xiàn)半夏上的病毒侵染與黃瓜花葉病毒(Cucumb

2、ermosaicvirus，CMV)有關(guān)，但是不知道其危害程度，也不清楚侵染半夏的CMV株系的遺傳背景是否一致。同時(shí)，CMV是公認(rèn)的植物病毒研究中的模式病毒，其與寄主的互作已被廣泛研究。半夏來(lái)源的CMV株系由于與寄主的長(zhǎng)期共同進(jìn)化而顯示出于與其它分離物的不同特征，所以本研究對(duì)分離自半夏的CMV株系進(jìn)行了全長(zhǎng)序列克隆，并對(duì)CMV基因組RNA1、RNA2和RNA3進(jìn)行了序列同源性分析，特別對(duì)RNA3的CP基因和3a進(jìn)行了深入的序列進(jìn)化分析；

3、同時(shí)，構(gòu)建了侵染半夏CMV株系的全長(zhǎng)侵染性克隆，通過(guò)與CMV標(biāo)準(zhǔn)株系Fny的重組交換研究了侵染半夏CMV株系的寄主生物學(xué)。 利用RT-PCR方法和雙酶切克隆，首次從半夏上獲得了CMV分離物(CMV-PGs)的全長(zhǎng)基因組序列。序列同源性分析結(jié)果表明：CMV-PGs屬于亞組ⅠB，PGs的RNA1全長(zhǎng)為3336nt，與Fny的RNA1的同源性為89.4％，而1a基因的序列同源性為89.1％，其1a蛋白的序列與Fny的1a蛋白序列同源性

4、為94.3％。RNA2全長(zhǎng)為3037nt，PGs的RNA2與Fny的RNA2的全長(zhǎng)序列同源性為87.6％，而2a基因編碼858個(gè)氨基酸的蛋白，其與Fny的2a序列同源性為87.1％，2a蛋白的序列與Fny的2a蛋白序列同源性為87.3％。PGs的RNA2的2b基因全長(zhǎng)333nt，編碼一個(gè)111的小蛋白，與Fny的2b相比較，其核苷酸序列水平的同源性僅76.6％，由此推倒出來(lái)的氨基酸水平的同源性為73.9％。 為了更加準(zhǔn)確地分析P

5、Gs-CMV的CP和3a序列進(jìn)化趨勢(shì)，加入了實(shí)驗(yàn)室分離的另外一個(gè)半夏分離物株系CMV-PNb的CP和3a序列，通過(guò)與其它已經(jīng)發(fā)表的38個(gè)CMV分離物的CP和3a共同分析表明：在核苷酸水平，所有分離物的CP基因和3a基因形成了亞組ⅠA和亞組ⅠB，從CP基因上分析，半夏來(lái)源的CMV應(yīng)該屬于亞組ⅠB，但是從3a基因上分析，半夏的CMV分離物明顯形成另外一個(gè)分支。在氨基酸水平，雖然CMV的亞組ⅠA和亞組ⅠB沒(méi)有明顯的差異，但是半夏分離物的CP基

6、因和3a基因都明顯形成了獨(dú)立的分支。根據(jù)上述的結(jié)果也表明半夏來(lái)源的CMV中，其CP基因所承受的選擇壓力要高于3a基因。 通過(guò)RT-PCR方法，構(gòu)建了侵染半夏的CMV株系分離物PGs的侵染性克隆，并進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄，獲得了RNA1、RNA2和RNA3的體外轉(zhuǎn)錄RNA，與CMV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株系Fny的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行重組交換構(gòu)建一系列完整的假重組體，生物學(xué)結(jié)果表明：接種14天后，加有Fny的RNA1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的假重組體均能在煙草和本氏煙上發(fā)

7、??；RNA3的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：接種7天后，本氏煙和煙草的接種葉上所有的假重組體均有復(fù)制，接種10天后，本氏煙的系統(tǒng)葉能檢測(cè)到CMV不同程度的復(fù)制，接種14天后，煙草的系統(tǒng)葉只能檢測(cè)到加有Fny的RNA1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的假重組體的復(fù)制，接種21天后，對(duì)本氏煙和煙草的系統(tǒng)葉進(jìn)行RNA3的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均只能檢測(cè)到加有Fny的RNA1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的假重組體在煙草寄主上的復(fù)制。 從生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：侵染半夏的CMV株

8、系分離物本身并沒(méi)有能夠系統(tǒng)侵染本氏煙和煙草，其基因組只有加上Fny的RNA1才能使整個(gè)CMV系統(tǒng)侵染煙草寄主，此外，假重組體均能在接種葉上進(jìn)行復(fù)制，PGs甚至還能在短期內(nèi)在本氏煙的系統(tǒng)葉進(jìn)行復(fù)制，這說(shuō)明了本文構(gòu)建的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有病毒活性。根據(jù)以上現(xiàn)象和分析，侵染半夏的CMV株系的分離物的RNA1就是導(dǎo)致CMV不能系統(tǒng)侵染本氏煙和煙草的基因組RNA。半夏上分離的CMV不能系統(tǒng)侵染兩種煙草的可能原因是，由于CMV對(duì)半夏寄主的長(zhǎng)期適應(yīng)性，導(dǎo)