GEM技術(shù)純化濃縮口蹄疫病毒抗原研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth diease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diease virus，F(xiàn)MDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的偶蹄獸動(dòng)物疫病，該病的發(fā)生可對(duì)經(jīng)濟(jì)及對(duì)外貿(mào)易造成極大影響。因而利用滅活疫苗對(duì)口蹄疫進(jìn)行預(yù)防和保護(hù)，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)目前國(guó)產(chǎn)的口蹄疫疫苗多為口蹄疫病毒滅活、配油佐劑制備而成，免疫副反應(yīng)大，此反應(yīng)大都由病毒抗原不純引起。因此亟需優(yōu)化改良口蹄疫病毒抗原的濃縮純

2、化技術(shù)，提升疫苗質(zhì)量。
　　GEM-PA表面展示系統(tǒng)是國(guó)外近年來研究發(fā)展起來的一種新型抗原制備技術(shù)。該系統(tǒng)由GEM顆粒（gram-positive bacterial enhancer matrix particles）和錨鉤蛋白PA(protein anchor)構(gòu)成。此項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白與PA融合后在GEM顆粒表面的展示。因此設(shè)計(jì)針對(duì)病毒抗原的納米抗體并與PA進(jìn)行融合，并在GEM顆粒表面展示，能夠?qū)Σ《究乖M(jìn)行濃縮純化。<

3、br>　　本研究成功建立了O型FMD滅活病毒的GEM純化方法。利用純化后的病毒抗原制備試驗(yàn)疫苗，初步評(píng)價(jià)其免疫效力，為今后研制高效的FMD疫苗奠定重要基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　試驗(yàn)Ⅰ不同個(gè)數(shù)LysM基序的錨鉤蛋白與GEM結(jié)合活性比較
　　比較三種含不同個(gè)數(shù)基序錨鉤蛋白PA的結(jié)合活性。首先應(yīng)用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增得到含有1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)自溶素基序(lysin motif，LysM)基因片段的PA、PA2與PA3;然后應(yīng)

4、用重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Nb構(gòu)建原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21(DE3)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白;最后將可溶性的PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb融合蛋白與GEM顆粒結(jié)合，經(jīng)Western-blot、透射電鏡與SDS-PAGE進(jìn)行結(jié)合鑒定與結(jié)合活性比較分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示裂解后可溶性的融合蛋白PA-Nb、PA2-Nb、PA3-Nb都能與GEM顆粒結(jié)合，PA2-Nb與GEM顆粒的結(jié)合活性明顯好于PA-Nb，PA2-N

5、b的表達(dá)量和可溶性明顯優(yōu)于PA3-Nb，PA2-Nb與GEM顆粒的結(jié)合活性與PA3-Nb相當(dāng)。因此PA2-Nb可作為下一步純化口蹄疫病毒的最優(yōu)接頭蛋白。本研究可為進(jìn)一步完善乳球菌外殼-蛋白錨鉤展示系統(tǒng)提供理論基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)Ⅱ GEM-FMDV純化系統(tǒng)基礎(chǔ)構(gòu)件的制備
　　GEM顆粒制備:乳酸乳球菌MG1363用GM17培養(yǎng)基30℃恒溫?fù)u床振蕩過夜，離心收集菌體，0.1 M HC1重懸，水浴煮沸30 min，離心洗滌3次，-8

6、0℃保存?zhèn)溆?。透射電鏡觀察結(jié)果表明，獲得的GEM顆粒保持原菌的形態(tài)大小，表面光滑，核酸蛋白已被完全除去。接頭融合蛋白制備:該蛋白N端為FMDV特異性納米抗體，C端為蛋白錨鉤。將本實(shí)驗(yàn)室保存的載體質(zhì)粒pET-28a(+)與pUC57-Pb雙酶切后連接，獲得重組錨鉤-納米抗體原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-Pb，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，接頭蛋白以部分可溶性蛋白形式表達(dá)，分子量32 kDa與理論值相

7、符。GEM顆粒-接頭蛋白復(fù)合物制備以及結(jié)合O型FMDV的初步鑒定:4ml接頭蛋白重懸1U GEM顆粒，室溫30 min，離心收集沉淀。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示GEM顆粒與接頭蛋白結(jié)合存在于離心后的沉淀中;Western-blot結(jié)果顯示GEM顆粒與接頭蛋白的結(jié)合是特異性的;透射電鏡觀察表明，GEM顆粒與接頭蛋白結(jié)合后，其表面有大量細(xì)小絮狀物。將GEM-Pb復(fù)合物與O型FMDV結(jié)合，分離上清和沉淀進(jìn)行初步鑒定。Western-blot

8、鑒定發(fā)現(xiàn)GEM-Pb能夠結(jié)合滅活的O型FMDV。
　　試驗(yàn)ⅢGEM純化O型FMDV方法建立及其免疫原性鑒定
　　將GEM-Pb復(fù)合物與滅活的O型FMDV(ZK株)混勻,37℃孵育1.5 h，9000 rpm離心10 min，分別收集上清與沉淀。SDS-PAGE電泳和Western-blot鑒定結(jié)果表明GEM顆粒-接頭蛋白復(fù)合物可特異性、高效地將FMDV固定在其表面，離心后上清中無病毒殘留，沉淀中僅存在FMDV、接頭蛋白和GE