BMSA菌毛島嶼PI-2a BP亞基基因抗原表位序列的克隆及原核表達(dá)產(chǎn)物抗原性研究.pdf

1、目的：在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的內(nèi)蒙古通遼地區(qū)，奶牛乳腺炎不僅嚴(yán)重威脅著奶牛的健康，而且為乳制品的安全性帶來了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。所以，研制出安全、高效的疫苗來防治奶牛乳腺炎迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過克隆奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP亞基基因，獲得其抗原表位基因編碼蛋白序列，經(jīng)構(gòu)建重組表達(dá)載體，使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白的亞基抗原性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌重組基因工程疫苗候選亞單位抗原提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　

2、方法：通過DNAMAN生物信息軟件分析Genbank中已有的無(wú)乳鏈球菌菌毛島嶼PI-2a的BP亞基抗原優(yōu)勢(shì)性表位基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)克隆引物，以通遼地區(qū)無(wú)乳鏈球菌臨床分離株總DNA為模板，克隆BP基因，測(cè)序后對(duì)其基因序列進(jìn)行分析與比對(duì)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-BP，轉(zhuǎn)化至E.coli/BL21（DE3）中工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)Western-blot對(duì)進(jìn)行免疫反應(yīng)原性鑒定。利用Ni2+層析柱

3、對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化，經(jīng)弗氏佐劑處理定期免疫家兔，制備兔抗BP抗體，建立檢測(cè)免疫抗體滴度的間接ELISA方法。
　　結(jié)果：克隆測(cè)序結(jié)果顯示，成功克隆奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP基因，序列長(zhǎng)609bp，共編碼203個(gè)氨基酸殘基。成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a(+)-BP，在大腸桿菌中獲得高效的可溶性原核表達(dá)，重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為33Ku，在裂解菌體的上清中可溶性蛋白表達(dá)量達(dá)到54.2％，純化