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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:在畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的內(nèi)蒙古通遼地區(qū),奶牛乳腺炎不僅嚴(yán)重威脅著奶牛的健康,而且為乳制品的安全性帶來了潛在的風(fēng)險(xiǎn)。所以,研制出安全、高效的疫苗來防治奶牛乳腺炎迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過克隆奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP亞基基因,獲得其抗原表位基因編碼蛋白序列,經(jīng)構(gòu)建重組表達(dá)載體,使其在大腸桿菌中高效表達(dá),并對(duì)表達(dá)蛋白的亞基抗原性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌重組基因工程疫苗候選亞單位抗原提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
2、方法:通過DNAMAN生物信息軟件分析Genbank中已有的無(wú)乳鏈球菌菌毛島嶼PI-2a的BP亞基抗原優(yōu)勢(shì)性表位基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)克隆引物,以通遼地區(qū)無(wú)乳鏈球菌臨床分離株總DNA為模板,克隆BP基因,測(cè)序后對(duì)其基因序列進(jìn)行分析與比對(duì)。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-BP,轉(zhuǎn)化至E.coli/BL21(DE3)中工程菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)Western-blot對(duì)進(jìn)行免疫反應(yīng)原性鑒定。利用Ni2+層析柱
3、對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行親和層析純化,經(jīng)弗氏佐劑處理定期免疫家兔,制備兔抗BP抗體,建立檢測(cè)免疫抗體滴度的間接ELISA方法。
結(jié)果:克隆測(cè)序結(jié)果顯示,成功克隆奶牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼骨架蛋白BP基因,序列長(zhǎng)609bp,共編碼203個(gè)氨基酸殘基。成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a(+)-BP,在大腸桿菌中獲得高效的可溶性原核表達(dá),重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為33Ku,在裂解菌體的上清中可溶性蛋白表達(dá)量達(dá)到54.2%,純化
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