HPV18型E7基因的克隆、表達(dá)及其融合蛋白的抗原性研究.pdf

1、目的： 1.利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定后，在大腸桿菌中表達(dá)HPV18E7融合蛋白。 2.制備HPV18E7融合蛋白診斷抗原，經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot法鑒定后，采用ELISA法用該診斷抗原檢測(cè)宮頸癌患者血清抗體水平，研究該蛋白的抗原性，為HPV18感染的診斷研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.設(shè)計(jì)能擴(kuò)增HPV18型E7蛋白基因

2、全長(zhǎng)序列的PCR引物，并在兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。通過基因克隆方法將PCR產(chǎn)物片段定向插入到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7，并經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序分析對(duì)其進(jìn)行鑒定。 2.將重組質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7轉(zhuǎn)化至E.ColiBL21(DE3)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，并用SDS-PAGE和Westernblot方法分析鑒定。 3.采用Ni-NTAAgarose親和層析

3、柱純化HPV18E7融合蛋白，并以HPV18型陽性血清作為一抗，進(jìn)一步用Westetrnblot分析該融合蛋白的抗原性。 4.以純化的HPV18F7融合蛋白作診斷抗原，用間接ELISA法檢測(cè)宮頸癌患者(88例)、尖銳濕疣患者(65例)及健康對(duì)照者77(例)血清IgG抗體。根據(jù)健康對(duì)照細(xì)血清平均A值計(jì)算出陽性判定值(即Cutoff值=健康對(duì)照組血清抗體平均A值+2S)，以分析目的蛋白用于診斷HPV18型感染的可行性。 5.

4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Tamhane法，各組間血清抗體陽性率的比較采用X2檢驗(yàn)法，顯著性檢驗(yàn)水平均為0.05。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序證明成功構(gòu)建pET32a(+)/HPV18E7重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒在大腸桿菌E.ColiBL21(DF3)內(nèi)成功表達(dá)了融合蚩向，經(jīng)SDS-PAGF電泳分析見約30kDa大小的蛋白條帶，并經(jīng)Westernblot鑒定為目的蛋白。

5、 2.HPV18E7融合蛋白純化后通過核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)的濃度為450μg/ml；以HPV18E7陽性宮頸癌患者血清作為一抗，經(jīng)Westernblot鑒定HPV18E7融合蛋白具有較強(qiáng)抗原性，成功制備并純化了用于宮頸癌診斷的ELISA抗原。以HPV18E7融合蛋白作為診斷抗原，用間接ELISA方法檢測(cè)宮頸癌患者、尖銳濕疣患者和健康對(duì)照者血清IgG抗體：①HPV18E7抗體ELISA讀數(shù)均值分別為0.605±0.328、0.287±0.2

6、02和0.342±0.225。三組間差異有顯著性意義(F=32.771，P＜0.001)。用Tamhane法進(jìn)一步兩兩比較分析結(jié)果顯示：宮頸癌組較尖銳濕疣組及健康對(duì)照組HPV18E7抗體均值差異均有顯著性意義(P＜0.01)，而尖銳濕疣組較健康對(duì)照組抗體均值差異無顯著性意義(P＞0.05)。②根掘健康對(duì)照組血清抗體的平均A值計(jì)算Cutoff值(為健康對(duì)照組血清抗體平均A值+2S)，HPV18E7抗體陽性率分別為17.0％(15/88)、

7、1.5％(1/65)和1.3％(1/77)。X2檢驗(yàn)顯示三組間HPV18E7抗體陽性率差異有顯著性意義(X2=17.774，P＜0.01)，宮頸癌組較尖銳濕疣組及健康對(duì)照組HPV18E7抗體陽性率差異均有顯著性意義(P＜0.01)，而尖銳濕疣組較健康劉。照組差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/HPV18E7；并在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)成功表達(dá)了融合蛋白。 2.以HP