仔豬生精細(xì)胞體外培養(yǎng)、增殖及分化研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較兩種生精細(xì)胞(spermatogeneniccell)的培養(yǎng)方法，觀察生精細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)行為，并檢測(cè)增殖分化情況，以建立精子發(fā)生體外培養(yǎng)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究精子發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并為治療雄性不孕、闡明環(huán)境污染物對(duì)雄性生殖的損害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還能為制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、挽救瀕危野生動(dòng)物提供新的思路。 采用生精細(xì)胞混合培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)進(jìn)行仔豬睪丸生精細(xì)胞體外培養(yǎng)，分別從生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程存活率、存活時(shí)間及分化程度

2、等方面進(jìn)行比較。結(jié)果顯示生精細(xì)胞混合培養(yǎng)過(guò)程中，檢測(cè)第1d)存活率為(91.66±0.46)％，第2d存活率達(dá)到(95.41±1.11)％，第3d存活率降低為(94.15±0.32)％；組織塊培養(yǎng)中生精細(xì)胞存活率一直較高且穩(wěn)定，檢測(cè)第1d存活率為(96±0.58)％，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，存活率逐步上升，第2d、3d存活率均為98％，與混合培養(yǎng)存活率相比，存活率差異極顯著(F=62.15，P＜0.001；q=3.59，P＜0.001)；生精

3、細(xì)胞混合培養(yǎng)5d后，生精細(xì)胞分化的最高程度為次級(jí)精母細(xì)胞，組織塊培養(yǎng)9d后生精細(xì)胞分化的最高程度為四分體精子細(xì)胞。 為了進(jìn)一步了解睪丸組織塊培養(yǎng)體系中生精細(xì)胞增殖及分化情況。本實(shí)驗(yàn)采取以下培養(yǎng)條件：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每毫升培養(yǎng)液中含有100IU青鏈霉素、Vc(10-4M)、VE(10μg/ml)、FSH(10-4mg/ml)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg/ml)，34℃，5％CO2，95％空氣二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，對(duì)

4、仔豬睪丸組織塊進(jìn)行了2～4周體外培養(yǎng)。通過(guò)溴脫氧核苷尿嘧啶(5'-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)體外標(biāo)記S期生精細(xì)胞DNA，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)生精細(xì)胞體外增殖情況；采用HE染色及透射電子顯微鏡技術(shù)從普通生態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面檢測(cè)體外培養(yǎng)前后生精細(xì)胞分化程度。結(jié)果顯示：(1)Brdu標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過(guò)15d，20d體外培養(yǎng)后生精細(xì)胞增殖明顯，體外培養(yǎng)15d可見(jiàn)大部分生精細(xì)胞以集落形式存在，呈念珠狀或啞鈴狀，少數(shù)

5、細(xì)胞以單細(xì)胞形式存在，集落包含有2-cell、4-cell、6-cell等偶數(shù)生精細(xì)胞集落，也包含奇數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)的細(xì)胞集落，如3-cell、5-cell、9-cell等，主要為小于10-cell細(xì)胞集落。體外培養(yǎng)20d，熒光顯微鏡圖顯示，仍可見(jiàn)許多細(xì)胞集落，集落多為2-cell及單個(gè)的生精細(xì)胞。(2)HE染色結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)15d，精原細(xì)胞通過(guò)間橋連接附著于支持細(xì)胞上，支持細(xì)胞核不規(guī)則，以2個(gè)核仁常見(jiàn)，偶見(jiàn)正在分裂的次級(jí)精母細(xì)胞，未見(jiàn)精

6、子細(xì)胞；體外培養(yǎng)第20d，可見(jiàn)多個(gè)正在分裂的次級(jí)精母細(xì)胞，還觀察到Sb、Sc型精子細(xì)胞，Sb型精子細(xì)胞胞核為圓形，胞核為藍(lán)紫色，胞核略微偏向一極；Sc型精子細(xì)胞胞核卵圓形，藍(lán)紫色，核偏極程度比Sc嚴(yán)重，染色質(zhì)較Sb致密。(3)透射電子顯微鏡結(jié)果表明支持細(xì)胞胞質(zhì)不如培養(yǎng)前豐富，線粒體明顯減少、輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)明顯變化。體外培養(yǎng)后觀察到了2個(gè)典型精子細(xì)胞，胞核呈“蘋果”狀，在細(xì)胞核頂端有高電子密度頂體囊泡形成，胞核一側(cè)可見(jiàn)高爾基體、線粒體