肝祖細(xì)胞體外培養(yǎng)和向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝衰竭具有病情危重、預(yù)后差、病死率極高，治療難度大的特點(diǎn)。人工肝支持療法已被證實(shí)是一種能夠暫時(shí)替代患肝的部分功能，為其肝細(xì)胞再生爭取時(shí)間，使患者得以過渡到自體肝功能恢復(fù)或肝移植的有效手段。人工肝支持療法自上世紀(jì)50年代始，從非生物型發(fā)展至今，已經(jīng)進(jìn)入到生物型，混合型的攻堅(jiān)階段。
　　 生物型/混合型人工肝得以起效，需要極大量(大于5×109)的具有良好活性和肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。選擇適合用于人工肝支持系統(tǒng)的

2、細(xì)胞源，是生物型/混合型人工肝的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。目前國際上研究較多的細(xì)胞源包括：成熟的人肝或豬肝細(xì)胞、人肝腫瘤的細(xì)胞系(如C3A等)、胎肝細(xì)胞、永生化肝細(xì)胞株(如本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的HepLL、HepLi4)，以及各種類型的干細(xì)胞。雖然細(xì)胞材料繁多，但目前尚無一種細(xì)胞源能完全滿足生物人工肝應(yīng)用的需要。
　　 肝祖細(xì)胞是肝臟來源的干細(xì)胞，同時(shí)具有肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞的表型，自我復(fù)制能力強(qiáng)，有向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞雙向分化的潛能，且在發(fā)育

3、學(xué)上與肝外來源的干細(xì)胞相比，具有更接近成熟肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的優(yōu)勢。因此，這類細(xì)胞被認(rèn)為是一種很有前景的用于肝病治療的細(xì)胞源。但是，肝祖細(xì)胞要作為生物人工肝的細(xì)胞源應(yīng)用于臨床，還有許多問題亟須解決。其中，進(jìn)一步明確影響肝祖細(xì)胞增殖和分化的因素，建立起安全高效的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化體系，是肝祖細(xì)胞得以更深入研究和廣泛應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。
　　 第一部分，膠原蛋白應(yīng)用于肝祖細(xì)胞的無血清培養(yǎng)的研究
　　 目的：本研究旨在應(yīng)用膠原蛋白

4、披覆的平板和無血清培養(yǎng)基相結(jié)合的方法優(yōu)化肝祖細(xì)胞的無血清培養(yǎng)，以建立更安全的肝祖細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　 方法：以源自TAT啟動(dòng)子-lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細(xì)胞系BMEL-TAT為肝祖細(xì)胞模型，以不同種類膠原蛋白披覆的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)平板和一種無血清培養(yǎng)基相結(jié)合的方式，連續(xù)培養(yǎng)肝祖細(xì)胞14天。選用的膠原蛋白包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質(zhì)量比1:1)，以及Ⅳ型膠原蛋白。以無膠原披覆的細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合同種無血清培養(yǎng)

5、基，或結(jié)合添加了5％胎牛血清的同種培養(yǎng)基組，分別作為實(shí)驗(yàn)的陰性對照和陽性對照。動(dòng)態(tài)觀測BMEL-TAT細(xì)胞在不同條件下的形態(tài)(倒置相差顯微鏡)、貼壁、增殖(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法、Cellscreen法)和向肝細(xì)胞方向自分化(X-gal染色、MUG檢測)的程度。
　　 結(jié)果：BMEL-TAT細(xì)胞在所測試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí)，均呈單層貼壁生長，與含血清培養(yǎng)組的生長模式相似，但其在無膠原的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí)，呈聚集生長模式

6、。在所測試的膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)時(shí)BMEL-TAT的貼壁速率、效率和增殖速率均高于普通培養(yǎng)板無血清組，其增殖速率與含血清培養(yǎng)組無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。X-gal染色和MUG檢測的結(jié)果基本一致，均提示在各種膠原蛋白披覆的培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT顯示出與含血清培養(yǎng)組相當(dāng)?shù)南蚋渭?xì)胞方向的自分化水平，但其自分化水平低于在普通培養(yǎng)板上無血清培養(yǎng)的BMEL-TAT自分化水平。膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合，以及Ⅳ型能等效地

7、促進(jìn)BMEL-TAT細(xì)胞的貼壁和增殖，對其生長模式和向肝細(xì)胞自分化的影響亦相當(dāng)。
　　 結(jié)論：選用膠原蛋白Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅰ型和Ⅲ型的混合(質(zhì)量比1:1)，以及Ⅳ型中的任何一種披覆細(xì)胞培養(yǎng)板，均能使BMEL-TAT細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)與常規(guī)含5％胎牛血清培養(yǎng)等效的生長、增殖和向肝細(xì)胞自分化的水平。
　　 第二部分，海藻酸-殼聚糖微囊包裹法應(yīng)用于肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的研究
　　 目的：本研究旨在評價(jià)海藻酸-

8、殼聚糖微囊包裹技術(shù)應(yīng)用于肝祖細(xì)胞向肝細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的可行性和有效性，以建立高效的便于放大規(guī)模的誘導(dǎo)分化體系，為肝祖細(xì)胞進(jìn)一步應(yīng)用于微囊相關(guān)的生物反應(yīng)器為核心的生物人工肝提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 方法：以源自TAT啟動(dòng)子-lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的具有雙向分化潛能的肝祖細(xì)胞系BMEL-TAT為細(xì)胞模型，以海藻酸-殼聚糖微囊包裹5×106/ml和2×106/ml兩種BMEL-TAT細(xì)胞密度。微囊包裹后在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天，動(dòng)態(tài)觀測微

9、囊內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)(倒置光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和增殖(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，以及微囊的機(jī)械強(qiáng)度。或是微囊包裹后先用生長培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，再換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)15天，動(dòng)態(tài)觀測細(xì)胞的形態(tài)(倒置光學(xué)顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡)、活力(FDA/PI雙染色)和向肝細(xì)胞方向分化的程度(熒光定量PCR檢測ALB、TAT、CK19和GGTⅣ基因的表達(dá)，尿素合成功能檢測)。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)以單層貼壁的BMEL-TAT作為對照

10、。
　　 結(jié)果：兩微囊組在生長培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)21天的過程中，包裹BMEL-TAT的海藻酸-殼聚糖微囊具有良好的機(jī)械性能，微囊內(nèi)BMEL-TAT細(xì)胞漸呈聚集生長趨勢，細(xì)胞聚集體形成的時(shí)間、數(shù)目和大小與包裹的細(xì)胞密度密切相關(guān)。微囊內(nèi)細(xì)胞具有良好活力，但增殖不明顯。
　　 兩微囊組在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基連續(xù)誘導(dǎo)15天的過程中，海藻酸-殼聚糖微囊內(nèi)BMEL-TAT細(xì)胞呈聚集生長趨勢，具有良好活力。熒光定量P

11、CR結(jié)果顯示海藻酸-殼聚糖微囊包裹的細(xì)胞密度高(5×106/ml)時(shí)，BMEL-TAT顯示出更好的向肝細(xì)胞的分化。細(xì)胞包裹密度5×106/ml的海藻酸-殼聚糖微囊組與單層貼壁組相比，BMEL-TAT細(xì)胞中成熟肝細(xì)胞相關(guān)基因(ALB、TAT)的上調(diào)，以及肝祖細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞相關(guān)基因(CK19)的下調(diào)均更顯著(P<0.05)。兩微囊組BMEL-TAT細(xì)胞的尿素合成量均在誘導(dǎo)前5天緩慢上升，而后迅速上升至誘導(dǎo)第10天出現(xiàn)高峰，隨后有所回落。

12、5×106/ml細(xì)胞密度微囊組BMEL-TAT的尿素合成量高于2×106/ml細(xì)胞密度微囊組，而2×106/ml細(xì)胞密度微囊組又高于單層貼壁組，其中5×106/ml密度微囊組的尿素合成高峰值是單層貼壁組高峰值的2.44倍，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。熒光定量PCR和尿素合成檢測的結(jié)果均提示細(xì)胞包裹密度5×106/ml的海藻酸-殼聚糖微囊能顯著促進(jìn)BMEL-TAT向肝細(xì)胞方向的分化。
　　 結(jié)論：海藻酸-殼聚糖微囊包裹能