不同胎齡人胚胎神經干細胞體外培養(yǎng)及增殖分化的研究.pdf

1、第一部分不同胎齡人胚胎神經干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定 研究背景與目的： 神經干細胞(neuralstemcell，NSC)是近來神經科學領域的研究熱點之一，研究顯示移植神經干細胞在治療急、慢性神經系統(tǒng)損傷以及多種神經系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化癥、Alzheimer癥、Parkinson病、Huntington癥、缺血性腦損傷方面具有廣闊的臨床應用前景…。但是不論是現階段的基礎研究還是將來的臨床應用都需要大量的神經干細胞，所

2、以對神經干細胞的分離、培養(yǎng)、分化都是現階段急需要解決的問題。建立穩(wěn)定、可靠的神經干細胞體外培養(yǎng)模式，是探索其增殖、分化機理和進行神經干細胞體內移植的基礎。本研究旨在獲得不同胎齡的人胚胎NSC，通過培養(yǎng)了解其生物學特性，為深入研究其增殖、分化機理奠定基礎。 方法： 1．從3～6周的人胚胎大腦皮層和神經管組織中以及7～18周的人胚胎大腦皮層中分離、培養(yǎng)及純化原代人胚胎NSC。按不同的基礎培養(yǎng)液分為2組：N2組和B27組，在體

3、外反復傳代培養(yǎng)以獲得純化的、能在體外長期生存的NSC。 2．NSC的鑒定：①單細胞克隆實驗檢測其自我更新能力；②免疫細胞化學檢測NSC特征性標志nestin的表達；③GFAP、NF200、Gal-C免疫細胞化學檢測其多向分化能力。 3．神經球計數檢測不同培養(yǎng)基對NSC的增生的影響，研究其生長特點。 結果： 1．從3～6周流產人胚胎大腦皮層和神經管組織中以及7～l8周的人胚胎大腦皮層中均分離獲得了可在體外生

4、存的細胞。采用懸浮細胞培養(yǎng)法，細胞能夠長期在體外生存并增殖。 2．經生長特征、形態(tài)學、免疫細胞化學等方法鑒定，結果顯示，培養(yǎng)的細胞在生長方式、形態(tài)結構、功能特征、表面標志等方面，均具有典型NSC的生物學特征。 3．神經球計數提示人胚胎NSC在B27培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系中增生情況顯著優(yōu)于N2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系(P<0．01)。 結論： 從3～18周人胚胎大腦皮層和3～6周人胚胎神經管組織中均成功分離得到了能在

5、體外長期生存并增殖的細胞，經體外培養(yǎng)及鑒定證明：該類細胞為人胚胎NSC，具有自我更新增殖能力及向神經細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞分化的潛能。人胚胎NSC在B27培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系中增生情況顯著優(yōu)于N2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系。 第二部分不同胎齡人神經干細胞的增殖及誘導分化為神經細胞的研究 研究背景與目的： 神經干細胞具有自我更新和多向分化潛能，在適宜的微環(huán)境的調控下能夠增殖并分化成神經細胞、星型膠質細胞和

6、少突膠質細胞。如果能通過體外培養(yǎng)獲得大量NSC，并誘導其分化成神經細胞，就可以為中樞神經系統(tǒng)損傷后的再生和功能重建提供細胞移植來源。對治療因神經細胞功能缺損而導致的腦血管病后遺癥、神經系統(tǒng)退行性病f如Alzheimer病，Parkinson病)等具有重大意義。不同胎齡來源的人神經干細胞在增殖、分化潛能上是否存在差異，是否應該選擇不同胎齡來源的人神經干細胞用于不同的臨床疾病的治療，是臨床應用神經干細胞前希望解決的問題。本研究在成功分離、培

7、養(yǎng)不同胎齡人胚胎神經干細胞的基礎上對其增殖和分化規(guī)律進行了比較，希望能為治療不同類型的中樞神經系統(tǒng)疾病，選擇更加恰當的神經干細胞積累實驗數據。 方法： 1．無菌條件下取3～18周的流產人胚胎，按胎齡大小分為3組：A組(3～6周)，B組(7～¨周)，C組(12～18周)，分離NSC，各組進行原代培養(yǎng)后進行純化，培養(yǎng)過程中觀察NSC的生長，計數神經球的數目以及直徑檢測其生長情況。 2．取不同胎齡組第2代NSC，接種于

8、6孔板中，貼壁培養(yǎng)2天后按培養(yǎng)液不同分為聯(lián)合組(bFGF+EGF+5％FCS+l％B27)，因子組(bFGF+EGF+l％B27)，血清組(5％FCS)，對照組(D／F12+1％B27)進行誘導分化，培養(yǎng)第12天時終止誘導，觀察NSC生長及分化情況，經免疫細胞化學(ICC)檢測細胞NF200的表達，統(tǒng)計陽性率，分析不同分化液對NSC定向誘導為神經細胞的作用，篩選出最佳分化作用的培養(yǎng)液。 3．取不同胎齡組培養(yǎng)的第2代NSC，接種于

9、6孔板中，貼壁培養(yǎng)2天后更換培養(yǎng)液為最佳分化作用的培養(yǎng)液，培養(yǎng)第12天時終止誘導，觀察生長、遷移、分化并形成神經網絡雛形的情況，并統(tǒng)計分化細胞表達NF200的陽性率。 結果： 1．在B27體外培養(yǎng)體系中，3～6周胎齡組人胚胎NSC的神經球數目明顯多于7～18周胎齡組人胚胎NSC的神經球數目(P<0．01)；3～6周胎齡組人胚胎NSC的直徑明顯大于7～18周胎齡組人胚胎NSC的的直徑(P<0．01)。 2．在聯(lián)合組

10、、因子組、血清組、對照組培養(yǎng)液中均可見NSC的生長和分化，而因子組培養(yǎng)液更有利于NSC分化為神經細胞(P<0．01)。 3．各胎齡組NSC定向分化為神經細胞的比例存在明顯差異，3～6周胎齡組NSC分化為神經細胞的比例顯著高于7～18胎齡組(P<0．01)。 結論： 因子組培養(yǎng)液能定向誘導分化人胚胎NSC為神經細胞；3～18周胎 齡組人胚胎NSC的增殖和分化能力存在顯著差異性，3～18周胎齡組NSC的增殖、