不同胎齡人胚胎神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)及增殖分化的研究.pdf

1、第一部分不同胎齡人胚胎神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定 研究背景與目的： 神經(jīng)干細胞(neuralstemcell，NSC)是近來神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，研究顯示移植神經(jīng)干細胞在治療急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化癥、Alzheimer癥、Parkinson病、Huntington癥、缺血性腦損傷方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景…。但是不論是現(xiàn)階段的基礎(chǔ)研究還是將來的臨床應(yīng)用都需要大量的神經(jīng)干細胞，所

2、以對神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)、分化都是現(xiàn)階段急需要解決的問題。建立穩(wěn)定、可靠的神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)模式，是探索其增殖、分化機理和進行神經(jīng)干細胞體內(nèi)移植的基礎(chǔ)。本研究旨在獲得不同胎齡的人胚胎NSC，通過培養(yǎng)了解其生物學(xué)特性，為深入研究其增殖、分化機理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．從3～6周的人胚胎大腦皮層和神經(jīng)管組織中以及7～18周的人胚胎大腦皮層中分離、培養(yǎng)及純化原代人胚胎NSC。按不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液分為2組：N2組和B27組，在體

3、外反復(fù)傳代培養(yǎng)以獲得純化的、能在體外長期生存的NSC。 2．NSC的鑒定：①單細胞克隆實驗檢測其自我更新能力；②免疫細胞化學(xué)檢測NSC特征性標志nestin的表達；③GFAP、NF200、Gal-C免疫細胞化學(xué)檢測其多向分化能力。 3．神經(jīng)球計數(shù)檢測不同培養(yǎng)基對NSC的增生的影響，研究其生長特點。 結(jié)果： 1．從3～6周流產(chǎn)人胚胎大腦皮層和神經(jīng)管組織中以及7～l8周的人胚胎大腦皮層中均分離獲得了可在體外生

4、存的細胞。采用懸浮細胞培養(yǎng)法，細胞能夠長期在體外生存并增殖。 2．經(jīng)生長特征、形態(tài)學(xué)、免疫細胞化學(xué)等方法鑒定，結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細胞在生長方式、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征、表面標志等方面，均具有典型NSC的生物學(xué)特征。 3．神經(jīng)球計數(shù)提示人胚胎NSC在B27培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系中增生情況顯著優(yōu)于N2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系(P<0．01)。 結(jié)論： 從3～18周人胚胎大腦皮層和3～6周人胚胎神經(jīng)管組織中均成功分離得到了能在

5、體外長期生存并增殖的細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)及鑒定證明：該類細胞為人胚胎NSC，具有自我更新增殖能力及向神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞分化的潛能。人胚胎NSC在B27培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系中增生情況顯著優(yōu)于N2培養(yǎng)基體外培養(yǎng)體系。 第二部分不同胎齡人神經(jīng)干細胞的增殖及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞的研究 研究背景與目的： 神經(jīng)干細胞具有自我更新和多向分化潛能，在適宜的微環(huán)境的調(diào)控下能夠增殖并分化成神經(jīng)細胞、星型膠質(zhì)細胞和

6、少突膠質(zhì)細胞。如果能通過體外培養(yǎng)獲得大量NSC，并誘導(dǎo)其分化成神經(jīng)細胞，就可以為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生和功能重建提供細胞移植來源。對治療因神經(jīng)細胞功能缺損而導(dǎo)致的腦血管病后遺癥、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病f如Alzheimer病，Parkinson病)等具有重大意義。不同胎齡來源的人神經(jīng)干細胞在增殖、分化潛能上是否存在差異，是否應(yīng)該選擇不同胎齡來源的人神經(jīng)干細胞用于不同的臨床疾病的治療，是臨床應(yīng)用神經(jīng)干細胞前希望解決的問題。本研究在成功分離、培

7、養(yǎng)不同胎齡人胚胎神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)上對其增殖和分化規(guī)律進行了比較，希望能為治療不同類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，選擇更加恰當?shù)纳窠?jīng)干細胞積累實驗數(shù)據(jù)。 方法： 1．無菌條件下取3～18周的流產(chǎn)人胚胎，按胎齡大小分為3組：A組(3～6周)，B組(7～¨周)，C組(12～18周)，分離NSC，各組進行原代培養(yǎng)后進行純化，培養(yǎng)過程中觀察NSC的生長，計數(shù)神經(jīng)球的數(shù)目以及直徑檢測其生長情況。 2．取不同胎齡組第2代NSC，接種于

8、6孔板中，貼壁培養(yǎng)2天后按培養(yǎng)液不同分為聯(lián)合組(bFGF+EGF+5％FCS+l％B27)，因子組(bFGF+EGF+l％B27)，血清組(5％FCS)，對照組(D／F12+1％B27)進行誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)第12天時終止誘導(dǎo)，觀察NSC生長及分化情況，經(jīng)免疫細胞化學(xué)(ICC)檢測細胞NF200的表達，統(tǒng)計陽性率，分析不同分化液對NSC定向誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞的作用，篩選出最佳分化作用的培養(yǎng)液。 3．取不同胎齡組培養(yǎng)的第2代NSC，接種于

9、6孔板中，貼壁培養(yǎng)2天后更換培養(yǎng)液為最佳分化作用的培養(yǎng)液，培養(yǎng)第12天時終止誘導(dǎo)，觀察生長、遷移、分化并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)雛形的情況，并統(tǒng)計分化細胞表達NF200的陽性率。 結(jié)果： 1．在B27體外培養(yǎng)體系中，3～6周胎齡組人胚胎NSC的神經(jīng)球數(shù)目明顯多于7～18周胎齡組人胚胎NSC的神經(jīng)球數(shù)目(P<0．01)；3～6周胎齡組人胚胎NSC的直徑明顯大于7～18周胎齡組人胚胎NSC的的直徑(P<0．01)。 2．在聯(lián)合組

10、、因子組、血清組、對照組培養(yǎng)液中均可見NSC的生長和分化，而因子組培養(yǎng)液更有利于NSC分化為神經(jīng)細胞(P<0．01)。 3．各胎齡組NSC定向分化為神經(jīng)細胞的比例存在明顯差異，3～6周胎齡組NSC分化為神經(jīng)細胞的比例顯著高于7～18胎齡組(P<0．01)。 結(jié)論： 因子組培養(yǎng)液能定向誘導(dǎo)分化人胚胎NSC為神經(jīng)細胞；3～18周胎 齡組人胚胎NSC的增殖和分化能力存在顯著差異性，3～18周胎齡組NSC的增殖、