半胱胺調(diào)控斜帶石斑魚生長的分子機理研究.pdf

1、魚類生長的內(nèi)分泌調(diào)控是通過刺激性和抑制性因子的雙重作用來實現(xiàn)的。生長抑素(somatostatin，SS)正是生長激素(growth hormone，GH)基礎性和刺激性分泌的最主要的抑制性因子。半胱胺可以通過抑制或削弱生長抑素作用，直接或間接的刺激GH的釋放，從而促進生長。本論文首次從斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)肝臟克隆了2種不同類型的斜帶石斑魚生長激素受體(gGHR1和gGHR2)。比較了2種生長激素受體的分

2、子結(jié)構(gòu)，同源性以及進化關系。運用Real-time PCR技術(shù)結(jié)合Northern雜交技術(shù)對2種生長激素受體在斜帶石斑魚不同組織表達情況進行了研究；通過RT-PCR技術(shù)研究了2種生長激素受體在斜帶石斑魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況。通過拌料投喂實驗，研究了不同劑量半胱胺(CS)以及促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A)對斜帶石斑魚幼魚生長的影響，從而尋找出一種合適劑量的CSH與LHRH-A藥物組合，指導斜帶石斑魚的人工養(yǎng)殖。 本研究

3、采用．RT-PCR以及RACE技術(shù)，從斜帶石斑魚肝臟克隆了2種不同類型的生長激素受體cDNA。斜帶石斑魚生長激素受體1型(gGHRl)cDNA全長2673bp(NCBI GenBank序列號，EF052273)，編碼658個氨基酸，其中胞外區(qū)為273個氨基酸，單次跨膜區(qū)為21個氨基酸，胞內(nèi)區(qū)為364個氨基酸；斜帶石斑魚生長激素受體2型(gGHR2)cDNA全長2989bp(NCBI GenBank序列號，EF052274)，編碼577個

4、氨基酸，其中胞外區(qū)為244個氨基酸，單次跨膜區(qū)為20個氨基酸，胞內(nèi)區(qū)為314個氨基酸。2種gGHR序列擁有78.6﹪的核苷酸同源性以及37.8﹪的氨基酸同源性。通過Northern雜交實驗，我們在斜帶石斑魚肝臟組織檢測到了單一的gGHR1信號，同時在斜帶石斑魚肝臟和肌肉組織測到了單一的gGHR2信號。在不同種類硬骨魚生長激素受體同源性分析中我們發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚gGHR1同鱸形目(黑鯛，金頭鯛，尼羅羅非魚)以及鰈形目(牙鲆，大菱鲆)魚類的

5、GHRl具有很高的同源性(81.3﹪．86.9﹪)；斜帶石斑魚gGHR2同鱸形目的一些魚類(黑鯛，金頭鯛，尼羅羅非魚)的GHRl具有很高的同源性(71.8﹪-80.4﹪)。 對硬骨魚生長激素受體的進化關系也進行了分析。斜帶石斑魚生長激素受體同鱸形目以及鰈形目的一些魚類的生長激素受體具有較近的進化親緣關系，而與鯉形目，鯰形目，鮭形目和鰻形目的一些魚類的生長激素受體具有較低的進化親緣關系。 采用Real-time PCR技術(shù)

6、對斜帶石斑魚2種gGHR的組織分布情況進行了研究。在垂體，下丘腦，脊髓，心臟，肝臟，肌肉等18種被測組織中均有檢測到2種gGHR的表達。在腦區(qū)，gGHR1在垂體中的表達量最高，在小腦和下丘腦的表達量最低；gGHR2在垂體，端腦和小腦的表達量最高，在下丘腦的表達量最低。在外周組織，2種gGHR在肝臟表達量最高，其次是肌肉和脂肪，而在其他外周組織表達量很低。同時采用Real-time PCR技術(shù)還比較了在同一組織中2種gGHR的表達差異。在

7、大多數(shù)組織，如：端腦，小腦，垂體，心臟和肌肉，gGHR2的表達量明顯高于gGHRl；而在肝臟和脊髓，gGHRl的表達量明顯高于gGHR2。同時采用RT-PCR技術(shù)研究了2種生長激素受體在斜帶石斑魚胚胎發(fā)育過程中的表達情況。斜帶石斑魚2種GHR mRNA在受精卵初期就可以檢測到表達，并且在胚胎發(fā)育各個時期都有顯著表達。 半胱胺鹽酸鹽(CSH)單獨投喂實驗發(fā)現(xiàn)，不同劑量的CSH均能顯著促進斜帶石斑魚幼魚的生長，提高魚體的肥滿度，對魚

8、體的內(nèi)臟比例沒有影響。CSH的促生長效果在一定范圍內(nèi)與劑量成正比。同時，運用：Real-time PCR技術(shù)對不同處理后的斜帶石斑魚GH及2種gGHR mRNA水平進行分析，發(fā)現(xiàn)CSH可以劑量依存的方式促進斜帶石斑魚腦垂體GH mRNA水平；同時，低劑量的CSH(1-3mg/g diet)可以劑量依存的方式提高斜帶石斑魚肝臟2種gGHR mRNA水平；而高劑量的CSH(4mg/g diet)則抑制2種gGHR mRNA水平，這可能同低劑

9、量的GH對GHR的上調(diào)節(jié)以及高劑量的GH對GHR的下調(diào)節(jié)有關。此外還發(fā)現(xiàn)，對于CSH刺激的敏感度上，gGHR2要明顯高于gGHR1。促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A)單獨投喂實驗結(jié)果表明，不同劑量的LHRH-A均能顯著促進斜帶石斑魚幼魚的生長，提高魚體的肥滿度，同時對魚體的內(nèi)臟比例沒有影響。其對斜帶石斑魚幼魚的促生長效果在一定范圍內(nèi)與劑量成正比。 最后通過混合投喂實驗，我們發(fā)現(xiàn)CSH與LHRH-A混合投喂能顯著促進斜帶石斑魚