17β-雌二醇和半胱胺調(diào)節(jié)斜帶石斑魚生長抑素Ⅰ(PSSI)表達(dá)的分子機制研究.pdf

1、生長抑素(somatostatin，SS)是一種抑制腦垂體分泌生長激素(growth hormone，GH)的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，廣泛分布于脊椎動物中樞和外周神經(jīng)組織，參與機體的生長、發(fā)育和代謝等多種生理功能。目前的研究表明，SS的表達(dá)受雌激素和半胱胺的影響。盡管這種調(diào)節(jié)存在種屬間的差異，但是對其調(diào)節(jié)的作用機制并不清楚。 本研究首次從斜帶石斑魚克隆了生長抑素前體基因Ⅰ(preprosomatostatin I，PSSI)5'上游啟動子序

2、列，構(gòu)建了5’端長度逐漸缺失的熒光素酶報告基因載體，瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)，大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞系(PC12)和褐鼠胰島素瘤上皮細(xì)胞(RIN-m)，采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測定不同DNA片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性；通過在體注射和離體孵育實驗，研究了17β-雌二醇(E2)對斜帶石斑魚PSSI mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)及其對PSSI基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的影響；研究了半胱胺鹽酸鹽(CSH)對離體斜帶石斑魚PSSI基因的調(diào)節(jié)及其上游啟動子區(qū)的影

3、響以及PKA和MAPK信號通路在CSH調(diào)節(jié)PSSI基因表達(dá)中的作用。主要研究結(jié)果如下： 1.采用GenomeWalker的方法，成功的從斜帶石斑魚肝臟中克隆得到PSSI基因5’旁側(cè)848 bp序列。與斜帶石斑魚PSSI cDNA5'—RACE序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始位點A位于翻譯起始位點ATG上游53 bp處。距離轉(zhuǎn)錄起始位點約29 bp存在一個TATA框(TATAA)。經(jīng)網(wǎng)上轉(zhuǎn)錄因子分析系統(tǒng)TESS軟件分析后發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑

4、魚PSSI基因5’旁側(cè)序列存在CRE、C/EBP、SP1、AP1、NF-1、1/2 ERE等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件位點。與大鼠約900bp的PSSI啟動子序列比較后發(fā)現(xiàn)，AP—2、AP—3、SRY和1/2 ERE結(jié)合位點僅存在于斜帶石斑魚PSSI啟動子中，在大鼠PSSI啟動子中并未發(fā)現(xiàn)這些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。 2.構(gòu)建了5’端長度逐漸缺失的啟動子報告基因重組體，并轉(zhuǎn)染PC12、MCF—7和RIN—m細(xì)胞，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測不

5、同啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。結(jié)果表明，PSSI全長啟動子在PC12和MCF—7細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性相對較高，在RIN—m細(xì)胞中活性很低，表明克隆的PSSI啟動子片段具有細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性。在PC12細(xì)胞中，pGL3-848表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄活性。其中，—848～—486 bp和—486～—373 bp區(qū)域可能分別存在正、負(fù)調(diào)控元件。在MCF—7細(xì)胞中，pGL3-149的轉(zhuǎn)錄活性最高。其中，—373～-149 bp區(qū)域可能存在負(fù)調(diào)控元件。

6、 3.研究E2對斜帶石斑魚PSSI mRNA的調(diào)節(jié)。給斜帶石斑魚腹腔注射低劑量E2(1μg/g B.W.)并不顯著促進(jìn)其下丘腦和卵巢PSSI mRNA的表達(dá)(P>0.05)，注射3μg/g B.W．E2和10μg/g B.W．E2后，均能顯著促進(jìn)下丘腦和卵巢PSSImRNA水平的表達(dá)(P<0.05)。其中，注射10μg/g B.W．E2后，能以時間依存方式促進(jìn)下丘腦和卵巢PSSI mRNA的表達(dá)(P<0.05)。離體靜態(tài)孵育實驗也表明，

7、E2能以劑量和時間依存方式促進(jìn)斜帶石斑魚下丘腦和卵巢PSSI mRNA的表達(dá)(P<0.05)。 4.研究E2對斜帶石斑魚PSSI基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。將構(gòu)建好的斜帶石斑魚PSSI啟動子報告基因重組體瞬時轉(zhuǎn)染MCF—7細(xì)胞，用10 nM E2作用細(xì)胞24 h后，pGL3-848啟動子活性增加1.69倍，顯著高于對照組活性(P<0.05)。若同時將雌激素受體表達(dá)載體pRST7ER與斜帶石斑魚PSSI基因啟動子共轉(zhuǎn)染MCF—7細(xì)胞

8、，并用10 nM的E2作用24 h后，pGL3-848轉(zhuǎn)錄活性比對照組提高了3.16倍(P<0.05)，但是并不顯著促進(jìn)pGL3-373和pGL3-149轉(zhuǎn)錄活性，說明—848～—373bp是雌激素調(diào)節(jié)斜帶石斑魚PSSI基因啟動子的重要功能區(qū)域，這可能與該區(qū)域含有5個1/2雌激素應(yīng)答元件(ERE)有關(guān)。 5.研究CSH對斜帶石斑魚PSSI mRNA的調(diào)節(jié)。用1 mM CSH作用離體孵育的斜帶石斑魚下丘腦腦片，在3h時，PSSI

9、mRNA水平達(dá)到最高，顯著高于對照組表達(dá)量(P＜0.05)。隨著孵育時間的延長，這種刺激作用開始減緩，到12 h時下丘腦PSSI mRNA表達(dá)量已低于對照組水平。用不同濃度CSH作用下丘腦腦片發(fā)現(xiàn)，低劑量0.01 mM CSH能輕微上調(diào)PSSI mRNA水平，但并未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。隨著CSH濃度增大，這種促進(jìn)PSSI mRNA表達(dá)的作用開始增強，在1 mM CSH作用下，PSSI mRNA表達(dá)水平最高(P＜0.05)。

10、 6.研究CSH對斜帶石斑魚PSSI基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。將構(gòu)建好的斜帶石斑魚PSSI啟動子報告基因重組體瞬時轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，用不同濃度CSH處理PC12細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，CSH并不能顯著促進(jìn)PSSI啟動子報告基因的轉(zhuǎn)錄活性(P＞0.05)，說明CSH可能是通過轉(zhuǎn)錄后水平或其他間接途徑上調(diào)PSSImRNA表達(dá)。 7.研究PKA和MAPK信號通路在CSH調(diào)節(jié)PSSI基因表達(dá)中的作用。結(jié)果表明，CSH能以時間和劑量依存方

11、式直接誘導(dǎo)斜帶石斑魚下丘腦腦片PKA和MAPK(ERK1/2)的磷酸化，提示PKA和MAPK信號途徑可能參與了CSH調(diào)控下丘腦神經(jīng)元功能變化的過程。用PKA抑制劑H89和Rp—cAMP以及MAPK抑制劑PD98059和U0126可以抑制CSH誘導(dǎo)的PKA和ERK1/2磷酸化，同時還能顯著抑制下丘腦PSSI mRNA表達(dá)，并且減緩CSH對PSSI mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。表明PKA和MAPK信號途徑參與了CSH促進(jìn)斜帶石斑魚PSSImRN