5株斜帶石斑魚腸道原籍菌的益生作用研究.pdf

1、本文以分離自健康斜帶石斑魚腸道的細(xì)菌為研究對(duì)象，通過對(duì)石斑魚潛在致病菌的抑制作用、對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受能力及生長(zhǎng)特性，獲得具有益生菌應(yīng)用前景的5株細(xì)菌；并以斜帶石斑魚為試驗(yàn)動(dòng)物，研究了這5株菌對(duì)其生長(zhǎng)、消化酶活性、免疫功能和胃腸道菌群的影響。試驗(yàn)分成以下四個(gè)部分：
　　 一5株益生菌的生物學(xué)特性研究
　　 體外研究了5株菌：DE5（Bacillus clausii）、SE5（Bacillus pumilus）、SE6（Ps

2、ychrobacter sp.）、MM1（Lactococcus lactis）和MM4（Enterococcus faecium）對(duì)石斑魚潛在致病菌的抑制作用和對(duì)胃腸道環(huán)境的耐受能力，并研究5株菌的生長(zhǎng)特性。結(jié)果表明，5株菌對(duì)4株指示菌（副溶血弧菌、哈維氏弧菌、梅氏弧菌和金黃色葡萄球菌）有選擇性地抑制作用。其中SE6、MM1和MM4對(duì)4株指示菌均有較強(qiáng)的抑制作用；DE5能夠選擇性地抑制哈維氏弧菌、梅氏弧菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，SE5

3、能夠選擇性地抑制副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5株菌的生長(zhǎng)速度有一定差異，其中SE5生長(zhǎng)速度最快，4 h就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；而其它4株菌相對(duì)較慢，8～12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。胃腸道環(huán)境耐受結(jié)果顯示，5株菌對(duì)不同pH值的人工胃液和不同膽鹽濃度的人工腸液均有一定的耐受能力，其中DE5對(duì)人工胃液的耐受能力最強(qiáng)，而SE6、SE5、MM4和MM1則次之；SE6對(duì)人工腸液的耐受能力最強(qiáng)，而SE5、DE5、MM4和MM1則次之

4、。以上結(jié)果提示：這5株菌對(duì)石斑魚潛在致病菌具有一定抑制效果，且生長(zhǎng)速度較快，對(duì)胃腸道環(huán)境有一定耐受能力，具有作為益生菌應(yīng)用的潛力。
　　 二飼料中添加益生菌對(duì)石斑魚生長(zhǎng)及部分消化酶活性的影響
　　 選擇體重40 g左右健康的斜帶石斑魚252尾，隨機(jī)分成6組，對(duì)照組TO和實(shí)驗(yàn)組T1、T2、T3、T4和T5，研究添加益生菌對(duì)生長(zhǎng)性能和消化酶活的影響。TO為不添加益生菌的基礎(chǔ)飼料，T1、T2、T3、T4和T5組分別在基礎(chǔ)日糧中

5、添加DE5、SE5、SE6、MM1和MM45株細(xì)菌（添加量為1×108個(gè)/g）。生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示：前期（0～30 d），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（T0）相比，末均重、平均增重、增長(zhǎng)率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)和存活率均無顯著性差異；但與T0相比，T3和T4組的末均重、平均增重、增重率和特定生長(zhǎng)率均有提高，餌料系數(shù)也均有降低；后期（31～60 d），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組（T0）相比，末均重沒有顯著性差異；T2組平均增重顯著高于T0，其它實(shí)驗(yàn)組與T0相比差

6、異均不顯著；增重率和特定生長(zhǎng)率T2和T5顯著高于T0，其它實(shí)驗(yàn)組與T0相比差異不顯著；餌料系數(shù)T1、T2、T3和T5顯著低于T0，T4與T0相比差異不顯著；各實(shí)驗(yàn)組與T0相比存活率差異均不顯著。全期（0～60 d）的結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組與T0相比，平均增重、增重率和特定生長(zhǎng)率均沒有顯著性差異，而T2組均有提高，除T5組外均顯著降低了餌料系數(shù)。
　　 酶活試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加5株菌對(duì)石斑魚肝胰臟和腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶有不同程度的

7、影響。肝胰臟酶活：與T0相比，T1組顯著提高了30 d肝胰臟胰蛋白酶和淀粉酶的活力，脂肪酶的活力也有明顯提高，但差異不顯著；對(duì)60 d肝胰臟胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性沒有顯著影響；T2組對(duì)30 d和60 d肝胰臟胰蛋白酶、淀粉酶和脂眵酶活力均沒有顯著的影響，但30 d和60 d肝胰臟胰蛋白酶、淀粉酶均有明顯提高，而對(duì)脂肪酶活力影響不大；T3、T4組對(duì)30 d和60 d肝胰臟胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均沒有顯著的影響；T5顯著提高了6

8、0 d肝胰臟胰蛋白酶活力，對(duì)30 d肝胰臟胰蛋白酶、30 d和60 d肝胰臟淀粉酶和脂肪酶活力沒有顯著的影響。腸道酶活：與對(duì)照組（T0）相比，T1、T2、T3、T4和T5對(duì)30 d和60 d腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力均沒有顯著的影響。
　　 三飼料中添加益生菌對(duì)石斑魚免疫功能的影響
　　 試驗(yàn)設(shè)計(jì)同第二章，研究添加益生菌對(duì)斜帶石斑魚免疫功能的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（T0）相比，添加芽孢桿菌DE5（T1組）30 d血

9、清溶菌酶活力提高了42.85％，顯著提高了60 d血清溶菌酶的活力；對(duì)30 d血清T-SOD活力沒有影響，而60 d T-SOD活力提高了11.43％；30 d和60 d IgM含量差異均不顯著；但30 d提高了38.89％，60d略低于對(duì)照組；補(bǔ)體C3水平在30 d和60 d分別提高了11.99％和15.9％：補(bǔ)體C4水平在30 d提高了6.37％，而對(duì)60 d補(bǔ)體C4水平影響不大；60 d白細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)顯著高于T0。添加

10、芽孢桿菌SE5（T2組）對(duì)30 d血清溶菌酶活力沒有影響，60 d提高了4.49％；與T0相比，30 d T-SOD活力變化不大，60 d提高了18.49％；30 d IgM含量提高了50％，而60 d IgM變化不大；30 d補(bǔ)體C3水平提高了11.17％，而60 d變化不大；30 d補(bǔ)體C4水平提高了11.43％，而60 d變化不大：60 d白細(xì)胞吞噬百分率提高了39.03％，吞噬指數(shù)也有提高，但與T0相比差異均不顯著。
　　

11、 添加嗜冷桿菌SE6（T3組）對(duì)30 d和60 d血清溶菌酶活力均沒有促進(jìn)作用；對(duì)30 d T-SOD活力沒有影響，60 d T-SOD活力提高了6.92％；30 d和60 d IgM含量分別提高了61.11％和12.12％；補(bǔ)體C3水平分別提高15.31％和33.58％；對(duì)30 d補(bǔ)體C4水平?jīng)]有影響，而60 d補(bǔ)體C4水平提高了13.77％；60 d白細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)均有提高。
　　 添加乳酸菌MM1和MM4對(duì)石斑

12、魚免疫功能也有一定的影響。與T0相比，添加乳酸菌MM1（T4）30 d和60 d血清溶菌酶分別提高了59.18％和25.84％；T-SOD活力分別提高了19.77％和6.92％；IgM含量分別提高77.78％和33.33％；補(bǔ)體C3水平分別提高11.72％和33.58％；補(bǔ)體C4水平分別提高了41.54％和3.85％；對(duì)60 d白細(xì)胞吞噬活性沒有影響。添加乳酸菌MM4（T5）對(duì)30 d和60 d血清溶菌酶活力均沒有促進(jìn)作用；對(duì)30 d

13、T-SOD活力沒有影響，60 d提高了2.79％；30 d和60 d IgM含量分別提高了61.11％和24.24％；補(bǔ)體C3水平分別提高了2.54％和37.56％；對(duì)30 d補(bǔ)體C4水平影響不大，而60 d提高了14.57％；60 d白細(xì)胞吞噬百分率提高了11.22％；吞噬指數(shù)也有提高。總之，添加5株益生菌對(duì)石斑魚免疫功能有一定的促進(jìn)作用。
　　 四飼料中添加益生菌對(duì)石斑魚胃腸道菌群的影響
　　 運(yùn)用PCR-DGGE技

14、術(shù)，研究了斜帶石斑魚胃和腸壁菌群的組成，以及添加5株益生菌對(duì)石斑魚胃和腸壁菌群的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，石斑魚胃和腸壁細(xì)菌16S rDNA V3基因片段產(chǎn)物經(jīng)DGGE技術(shù)分離，共得到14條共有條帶。相似性分析結(jié)果表明，石斑魚胃和腸壁菌群具有較高的相似性，不同個(gè)體之間存在一定的差異。對(duì)胃和腸壁共有條帶（14條）進(jìn)行切膠測(cè)序，結(jié)果顯示，斜帶石斑魚胃和腸壁的優(yōu)勢(shì)菌為Pseudomonas、Uncultured gamma proteobacter

15、ium、Bacillus、Nitratireductor、DietZia、Methylobacterium、Microbacterium和一些不可培養(yǎng)細(xì)菌。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，添加5株益生菌對(duì)石斑魚胃和腸壁優(yōu)勢(shì)菌群組成有不同程度的影響。與對(duì)照組（T0）相比，添加芽孢桿菌DE5（T1組）組胃中葡萄球菌消失，而放線菌屬細(xì)菌的定植增加，出現(xiàn)了發(fā)光菌屬細(xì)菌；前腸中出現(xiàn)了發(fā)光菌屬細(xì)菌和芽孢桿菌的定植；前腸和后腸中出現(xiàn)了腸球菌屬細(xì)菌和弧菌的定植。添加芽

16、胞桿菌SE5（T2組），胃中出現(xiàn)了葡萄球菌屬細(xì)菌和不可培養(yǎng)細(xì)菌的定植，不可培養(yǎng)芽孢桿菌屬細(xì)菌等在胃中的定植增加，而不可培養(yǎng)芽孢桿菌屬細(xì)菌在前腸和后腸中的定植也增加了。添加嗜冷桿菌SE6（T3組），胃中出現(xiàn)了滕黃微球菌、α-變形菌和β-變形菌的定植；前腸和后腸中芽孢桿菌的定植降低，出現(xiàn)了不可培養(yǎng)α-變形菌和Alcanivorax dieselolei的定植。添加乳酸菌MM1（T4組），葡萄球菌和芽孢桿菌在胃中消失，而出現(xiàn)了不可培養(yǎng)鞘氨醇桿