玉米干燥后熟過(guò)程差異表達(dá)蛋白R(shí)AB17的相關(guān)分析.pdf

1、農(nóng)作物種子的發(fā)育都要經(jīng)過(guò)干燥脫水這個(gè)階段走向成熟，而干燥脫水又是農(nóng)作物種子從休眠走向萌發(fā)的橋梁。種子胚和胚乳在干燥脫水過(guò)程中，特定蛋白質(zhì)存在著差異變化，對(duì)胚和胚乳干燥后熟過(guò)程發(fā)揮著重要影響。對(duì)在干燥后熟過(guò)程胚和胚乳中蛋白質(zhì)組變化的研究有助于我們更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)玉米種子的干燥脫水過(guò)程。
　　脫落酸響應(yīng)蛋白(Responsive to ABA，RAB)RAB17屬于脫水素家族(DHNs)，也屬于胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryo

2、genesis abundantprotein,LEA)第二家族LEAⅡ，它在成熟脫水后的種子中大量存在，在萌發(fā)后降解，對(duì)種子脫水耐性的形成和干燥后熟過(guò)程發(fā)揮著重要的作用，影響著種子的萌發(fā)。研究表明，RAB17在細(xì)胞內(nèi)存在著多種生理功能，在干旱，低溫，鹽堿等多種逆境脅迫下均有表達(dá)，它在細(xì)胞內(nèi)還能穩(wěn)定大分子及其細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對(duì)RAB17的研究很多，在細(xì)胞內(nèi)RAB17的功能受到細(xì)胞內(nèi)激酶CK2的調(diào)節(jié)。
　　Marta Riera等(200

3、4)通過(guò)對(duì)玉米胚中提取物的體外磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，RAB17蛋白的磷酸化可能由CK2蛋白激酶以外的一種蛋白激酶參與其磷酸化。在逆境脅迫條件下，Goday等(1994)研究發(fā)現(xiàn)，番茄RAB17同源蛋白TAS14在體外由CK2和一個(gè)cAMP依賴型蛋白激酶磷酸化，但是，沒有進(jìn)一步的報(bào)道。
　　脫落酸響應(yīng)蛋白R(shí)AB17在玉米自交系08-641全種子脫水干燥前后有差異表達(dá)。對(duì)玉米自交系S37穗自然干燥處理，利用雙向電泳技術(shù)分析了其自然干燥前后胚

4、和胚乳蛋白質(zhì)組的變化，并在胚中同樣檢測(cè)到存在著上調(diào)表達(dá)的蛋白R(shí)AB17。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果，采用巢式PCR的方法從玉米自交系08-641種子胚中克隆rab17基因，構(gòu)建RAB17原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)原核表達(dá)蛋白，并對(duì)原核表達(dá)蛋白純化制備螯合層析柱，從具有活性的玉米胚全蛋白中Pull-down篩選互作蛋白，通過(guò)雙向電泳質(zhì)譜分析鑒定互作蛋白。利用生物信息學(xué)方法，完成了rab17核酸和編碼蛋白的特征分析、進(jìn)化關(guān)系，還對(duì)篩選到

5、互作蛋白LOC100276911進(jìn)行了分子量、等電點(diǎn)、結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)進(jìn)化關(guān)系等分析，利用分析結(jié)果，克隆了該互作蛋白的基因、并進(jìn)行了原核表達(dá)，用于后期更進(jìn)一步的研究。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，共計(jì)鑒定出自交系S37穗自然干燥前后胚中差異表達(dá)蛋白30個(gè)和胚乳中差異表達(dá)蛋白16個(gè)，其中在胚中檢測(cè)到與自交系08-641干燥后熟后同樣上調(diào)表達(dá)的蛋白R(shí)AB17，但兩者存在不一致，即RAB17蛋白存在表

6、達(dá)多態(tài)性。
　　(2)依據(jù)對(duì)自交系08-641全種子干燥后熟過(guò)程差異表達(dá)蛋白R(shí)AB17分析結(jié)果，從其成熟胚中克隆得到了長(zhǎng)度為507bp的rab17CDS區(qū)。生物信息學(xué)表明，其具有等位基因差異性和表達(dá)多態(tài)性。
　　(3)通過(guò)構(gòu)建rab17的原核表達(dá)載體，成功表達(dá)帶6xHis的原核表達(dá)蛋白和提取玉米胚活性蛋白，pull-down篩選到了RAB17蛋白的互作蛋白，通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜鑒定該蛋白為L(zhǎng)OC100276911。
　　

7、(4)生物信息學(xué)分析表明，互作蛋白在禾本科植物中具有一定的保守性。從玉米胚中克隆了其表達(dá)基因的CDS區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功得到了原核表達(dá)蛋白。
　　綜上，我們成功從自交系S37中鑒定到了干燥后熟差異表達(dá)蛋白R(shí)AB17，從自交系08-641成熟玉米胚中克隆了rab17，得到了其互作蛋白LOC100276911，闡述了RAB17蛋白在玉米自交系中具有表達(dá)多態(tài)性，其在玉米脫水后熟過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步進(jìn)行互作蛋白酵母雙雜交驗(yàn)