茶樹種子低溫貯藏過程中熱激蛋白的差異表達(dá)與分析.pdf

1、茶樹是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。我國(guó)是茶樹的起源地,種質(zhì)資源極其豐富,在茶樹分類系統(tǒng)的37個(gè)種和3個(gè)變種中,除毛肋茶外,其余全產(chǎn)在中國(guó)。目前在茶樹種質(zhì)資源的保存問題上,因種子貯藏特性偏向于頑拗型種子,既不耐低溫又不耐干燥,而不得不采用種植保存。這種保存方式不僅占用大量的土地和人力資源,還極易受外界環(huán)境影響。離體培養(yǎng)技術(shù)由于需要長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)不僅費(fèi)錢費(fèi)力,而且會(huì)引起遺傳不穩(wěn)定性。更為麻煩的是茶樹是多年生木本植物,多

2、酚類含量很高,目前的技術(shù)和水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到中、長(zhǎng)期保存種質(zhì)資源的要求。 茶樹種子是茶樹本身自然繁殖的后代,貯藏著完整的遺傳信息,作為保存材料攜帶、運(yùn)輸和貯藏都非常方便,對(duì)繁衍和傳播具有重要作用,長(zhǎng)期保存種子是解決品種退化的關(guān)鍵,因此研究茶樹種子貯藏的意義顯得尤為重要。傳統(tǒng)貯藏種子的方法是沙藏法,即保存在一定濕度、溫度和通氣條件的環(huán)境中,但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)芽率迅速下降,半年后只有20％左右。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)這方面的研究較少,少數(shù)幾

3、篇研究對(duì)保存方法進(jìn)行了初步有益的嘗試。但是迄今少有對(duì)種子在保存過程中生理、生化和細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行研究,更少涉及到分子生物學(xué)機(jī)理。 cDNA-AFLP技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種重要的轉(zhuǎn)錄基因組學(xué)研究工具,因其可靠性高、重復(fù)性好、且不需要預(yù)先知道序列信息、所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,被廣泛應(yīng)用于基因差異表達(dá)的研究。本研究針對(duì)茶樹種子不耐低溫貯藏的情況,以茶樹中的高結(jié)實(shí)率品種龍井43為研究對(duì)象,通過cDNA-AFLP方法研究同一茶樹品種種子低溫

4、貯藏前后的基因表達(dá)譜的差異表現(xiàn)特征,并結(jié)合RT-PCR對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行鑒定,以生物信息學(xué)手段對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測(cè)。并對(duì)與低溫誘導(dǎo)有關(guān)的未知功能基因的序列,用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆其全長(zhǎng)cDNA序列并進(jìn)行序列分析。希望能夠揭示茶樹種子對(duì)低溫誘導(dǎo)的相關(guān)分子機(jī)制,通過研究取得了如下結(jié)果： (1)對(duì)低溫處理茶籽和新鮮對(duì)照茶籽進(jìn)行8對(duì)引物組合的差異顯示分析,發(fā)現(xiàn)低溫處理樣和新鮮對(duì)照樣的茶籽之間存在表達(dá)

5、差異。 在所鑒定的10個(gè)差異片段中,有2個(gè)片段序列沒有發(fā)現(xiàn)同源序列；有1個(gè)片段序列與未知功能蛋白相關(guān)；其余7個(gè)差異表達(dá)的片段序列分別與小分子量熱激蛋白、MYB類轉(zhuǎn)錄因子、衰老相關(guān)蛋白、F-box家族蛋白、蛋白激酶、磷酸二酯酶1,4-α-葡聚糖-麥芽水解酶等基因有同源性。 (2)利用RACE技術(shù)得到了TDF3 cDNA全長(zhǎng),全長(zhǎng)為819bp。經(jīng)BLAST查詢比對(duì),該基因序列與小分子量熱激蛋白有很高的同源性。TDF3的ORF