腫瘤干細胞樣人胰腺癌細胞在癌侵襲、轉移中作用的實驗研究.pdf

1、第一部分人胰腺癌細胞系成球能力及其CD44、CD24和ESA表達的研究
　　 目的:研究不同人胰腺癌細胞系在特殊低粘附培養(yǎng)條件下的成球能力以及該培養(yǎng)條件對其胰腺癌干細胞標志CD44、CD24和ESA表達的影響。
　　 方法：采用特殊的低粘附培養(yǎng)條件（SFM），觀察四種不同人胰腺癌細胞系(PANC-1，PC-2，MIA-Paca-2和BxPC-3)在該培養(yǎng)條件下形成腫瘤細胞球的能力。應用流式細胞術檢測胰腺癌干細胞標志CD4

2、4、CD24和ESA在不同細胞系成球前后的變化，分析SFM 培養(yǎng)對其CD44、CD24和ESA表達的影響。
　　 結果：四種人胰腺癌細胞系(PANC-1，PC-2，MIA-Paca-2和BxPC-3)中，只有PANC-1和MIA-Paca-2在SFM 培養(yǎng)下形成了腫瘤細胞球；在MIA-Paca-2和PC-2細胞中，只檢測到CD44的表達。在PANC-1細胞中，檢測到CD44和CD24的表達，而在BxPC-3中，三種標志物CD44

3、、CD24和ESA 都有表達；在PANC-1 腫瘤細胞球中，CD44 陽性表達率下降(85.21％±8.74％ v.98.88％±2.38％)，CD24 陽性表達率上升(13.32％±6.15％ v．1.22％±0.57％)，CD24+CD44+上升(12.60％±5.10％ v．1.43％±0.59％)，在MIA-Paca-2 腫瘤細胞球中，CD44 陽性表達率無明顯變化(99.4±0.37％ v.99.43％±0.30％)。

4、　　 結論：人胰腺癌細胞系PANC-1和MIA-Paca-2 具有在SFM 培養(yǎng)下形成腫瘤細胞球的能力，胰腺癌干細胞標志CD44、CD24和ESA在不同細胞系中的表達存在明顯的不同，SFM 培養(yǎng)可以引起CD44、CD24和ESA表達的變化。
　　 第二部分人胰腺癌細胞系PANC-1 腫瘤細胞球生物學特性及其SHH表達的研究
　　 目的：鑒定人胰腺癌細胞系PANC-1 腫瘤細胞球在分化、致瘤性等方面的生物學特性并檢測其S

5、HH的表達。
　　 方法：將PANC-1 腫瘤細胞球改在有血清培養(yǎng)基（SCM）中進行培養(yǎng)，誘導其分化，通過流式細胞術分析其胰腺癌干細胞標志CD44、CD24和ESA的表達測定其分化能力。通過BALB/c-scid 小鼠異種移植成瘤試驗比較PANC-1 腫瘤細胞球與PANC-1細胞的成瘤能力，同時采用實時熒光定量PCR和Western blot分別檢測SHHmRNA 及SHH 蛋白在PANC-1 腫瘤細胞球中的表達。
　　

6、 結果：PANC-1 腫瘤細胞球經(jīng)誘導分化后，CD44+上升(94.80±4.77％ v.85.21±8.74％)，CD24+下降(1.57％±0.68％ v．13.32％±6.15％)，CD44+CD24+下降(1.55％±0.75％ v．12.60％±5.10％)，ESA-，與其來源PANC-1細胞相比，CD44、CD24和ESA的表達情況相同；在PANC-1細胞組，至少需要接種5×10 4個細胞才有腫瘤結節(jié)形成（1/3），而在PA

7、NC-1 腫瘤細胞球組，最少接種1×10 4個細胞即可觀察到腫瘤形成（3/3）。組織切片HE 染色顯微鏡下觀察，二者所形成移植瘤在組織結構方面無明顯差異；與PANC-1細胞相比，PANC-1 腫瘤細胞球細胞中SHHmRNA 及SHH 蛋白表達均明顯升高，分別為(4.23±0.85v．1.52±0.60)和 (0.374±0.012 v．0.274±0.023)。
　　 結論：PANC-1 腫瘤細胞球具有腫瘤干細胞樣生物學特性，其

8、SHH表達無論在mRNA 還是在蛋白水平均有明顯上調。
　　 第三部分腫瘤干細胞樣人胰腺癌細胞在癌侵襲、轉移中作用的實驗研究
　　 目的：研究腫瘤干細胞樣人胰腺癌細胞在胰腺癌侵襲、轉移中的作用并探討其作用與上皮-間質轉化（EMT）的關系。
　　 方法：采用Transwell 小室體外遷移和侵襲實驗，分別測定PANC-1 腫瘤細胞球細胞在體外的運動和侵襲能力。通過BALB/c-scid 小鼠脾臟移植肝轉移實驗測定其

9、肝轉移潛力。同時采用Western blot 法分別檢測E-cadherin與Vimentin 蛋白在PANC-1 腫瘤細胞球中的表達。
　　 結果：與PANC-1細胞相比，PANC-1 腫瘤細胞球細胞在體外的遷移和侵襲能力明顯增強，分別為（1374.6±50.15v．521±34.63）和（128±7.64 v.79±17.51）；當接種1×10 5個細胞時，PANC-1 腫瘤細胞球組即可查見肝轉移（4/12），而在PANC-

10、1細胞組，當接種個5×10 5細胞時，才有肝轉移發(fā)生（2/12），當分別接種5×10 5，1×10 6，5×10 6個細胞時，雖然兩組小鼠中都證實有肝轉移發(fā)生，但是與PANC-1細胞組相比，PANC-1 腫瘤細胞球組轉移發(fā)生率增加，兩組間差異均有顯著性；與PANC-1細胞相比，PANC-1 腫瘤細胞球細胞中E-cadherin 蛋白水平降低（0.415±0.005v．0.504±0.006），Vimentin 蛋白水平升高（0.504±