乙酰肝素酶反義寡核苷酸抑制人胰腺癌細胞侵襲力的實驗研究.pdf

1、胰腺癌由于其侵襲性生物學行為而預后很差，絕大多數病人診斷明確時往往屬于病程晚期，已經發(fā)生局部侵潤和遠處轉移，喪失了早期根治性手術切除的機會。即使手術切除，術后復發(fā)率仍很高，預后仍未得到改善。聯(lián)合輔助治療可能給少數病人帶來生存的機會，但其療效仍未得到明確的公認。吉西他賓是目前公認對緩解病情唯一有效的一類細胞毒性藥物，但其改善預后和提高長期生存率的效果極其有限。 反義寡核苷酸(Antisenseoligoxydeonucleotid

2、e，AS-ODN)技術是將與靶基因序列互補的小分子寡核苷酸導入細胞，通過激活核酶RnaseH等機制，促使mRNA降解，抑制轉錄過程，從而阻止蛋白合成。因此，AS-ODN技術有高度的特異性。本研究采用脂質體將靶向HPSEAS-ODN導入人胰腺癌細胞中，觀察其對HPSEmRNA和蛋白表達、胰腺癌細胞生長及體外侵襲力的影響；通過建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，觀察HPSEAS-ODN在體內的抑瘤效果。希望通過本實驗為下一步臨床應用HPSEAS

3、-ODN治療胰腺癌提供一定的實驗依據。 第一部分乙酰肝素酶在人胰腺癌組織中表達的意義 目的:探討乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義。 方法:1.采用同濟醫(yī)院病理科1998年～2003年胰腺癌切除術標本50例，男性36例，女性14例。年齡41歲～77歲，平均63歲。高分化2例，中分化35例，低分化13例。臨床病理分期按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)聯(lián)合制定的TNM分期方案進行，

4、其中Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期27例，Ⅳ期8例。無淋巴結轉移18例，有淋巴結轉移32例。 2.用免疫組織化學SP方法檢測50例胰腺癌切除標本中HPSE的表達，并分析其與臨床病理指標的關系。 結論:1.HPSE表達與TNM分期無明顯關系，提示早期胰腺癌組織可能高表達HPSE，這與胰腺癌的侵潤轉移特性可能有關。 2.HPSE表達與腫瘤分化程度無明顯關系，提示高分化胰腺癌有高表達HPSE的可能。因此，對高分化胰腺癌臨床上

5、也不應輕視其侵潤轉移特性。 3.盡管有無淋巴結轉移與胰腺癌高表達HPSE無明顯統(tǒng)計學差異，但有淋巴結轉移的胰腺癌表達HPSE有更高的趨勢(P=0.06)。 4.檢測HPSE蛋白表達對于預測胰腺癌轉移潛能具有一定參考價值。 第二部分：乙酰肝素酶反義寡核苷酸對人胰腺癌細胞體外侵襲力的影響 目的:觀察乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleot

6、ide，AS-ODN)對人胰腺癌細胞系Panc-1細胞HPSE基因表達、胰腺癌細胞生長及體外侵襲力的影響，為臨床應用HPSEAS-ODN治療胰腺癌提供一定的實驗依據。 方法:1.細胞培養(yǎng)：人胰腺癌細胞株Panc-1購于北京協(xié)和醫(yī)院。 2.合成HPSEAS-ODN，序列為：5'-GGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3'；無義寡核苷酸(nonsenseoligodeoxynucleotide，NS-ODN)作為對照。

7、 3.實驗分組：AS-ODN組(用脂質體將HPSEAS-ODN轉染Panc-1細胞)，NS-ODN組(用脂質體將NS-ODN轉染Panc-1細胞)，對照組(未轉染)。 4.逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)：檢測轉染后HPSEmRNA表達的變化。 5.Western印跡法：檢測轉染后Panc-1細胞HPSE蛋白表達的變化。 6.MTT法：檢測轉染后Panc-1細胞相對存活率。 7.Transwel

8、l侵襲室方法：檢測轉染后Panc-1細胞的體外侵襲力。 結論:1.靶向AS-ODN抑制人胰腺癌細胞HPSEmRNA和蛋白的表達。 2.靶向AS-ODN抑制人胰腺癌細胞體外生長。 3.靶向AS-ODN降低人胰腺癌細胞的體外侵襲力。 4.本實驗結果為臨床應用HPSEAS-ODN治療胰腺癌提供了一定的實驗依據。 第三部分：乙酰肝素酶反義寡核苷酸對人胰腺癌裸鼠移植瘤生長的影響 目的:觀察乙酰肝素酶(

9、heparanase，HPSE)反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)對裸鼠人胰腺癌細胞皮下移植瘤生長和基因表達的影響作用。 方法:1.細胞培養(yǎng)：人胰腺癌細胞株Panc-1購于北京協(xié)和醫(yī)院。 2.合成HPSEAS-ODN，序列為：5'-GGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3'；無義寡核苷酸(nonsenseoligodeoxynucleotide，NS-ODN)作為

10、對照。 3.建立裸鼠人胰腺癌細胞Panc-1皮下移植瘤模型：BALB/C雄性裸鼠15只，6～8周齡，體重18～22g，由湖北省防疫站動物中心提供。每只裸鼠于背部皮下接種0.2ml細胞懸液(Panc-1細胞濃度為1×108/ml)。 4.實驗分組：隨機分為AS-ODN治療組(皮下注射AS-ODN10mg/kg體重)，NS-ODN治療組(皮下注射NS-ODN10mg/kg體重)，對照組(皮下注射生理鹽水0.2ml/只)。隔日