冷凍對人精子核DNA損傷、凋亡、線粒體膜電位的影響.pdf

1、[目的]精子冷凍技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生殖領(lǐng)域，它可以為人類提供生殖保險，為不孕不育夫婦提供合格的精子。但是冷凍過程中冰晶的形成以及氧化應(yīng)激反應(yīng)會對精子造成損傷（包括精子細(xì)胞膜、DNA、精子活力、線粒體功能等），運(yùn)動能力的減弱、DNA的損傷則導(dǎo)致了精子授精能力的下降。線粒體是定位于精子尾部的能量供應(yīng)中心，和精子運(yùn)動能力密切相關(guān)：同時線粒體又是凋亡通路之一，在細(xì)胞凋亡的過程中起著樞紐作用，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程

2、中最早發(fā)生的事件。在本研究中，我們主要觀察：1.冷凍儲存對精子的運(yùn)動能力、畸形率、膜脂類過氧化反應(yīng)、DNA損傷及線粒體膜電位、凋亡等的影響及各項(xiàng)指標(biāo)之間是否存在相關(guān)性。2.比較冷凍對正常、異常精液影響的大小，以便對以后的自精保存工作提出指導(dǎo)意見。
　　 [方法]2009年3月～6月于山東省人類精子庫（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院）隨機(jī)選取正常精液樣本、異常精液樣本各30例（根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999年的標(biāo)準(zhǔn)：精子密度>20×109/L，活

3、動率>60％，a級精子>25％或a+b級精子>50％，精子正常形態(tài)率>30％為正常精液，其他為異常精液）。志愿者禁欲3～7d，留取精液于無菌瓶內(nèi)，在室溫下完全液化后，行精液常規(guī)檢查。所有標(biāo)本均采用Endtz實(shí)驗(yàn)排除白細(xì)胞精子癥者。每份精液標(biāo)本留取lmL，其中0.5ml精液用于檢測凍前指標(biāo)。采用精子形態(tài)學(xué)快速染色(Diff-Quik法)試劑盒檢測精子的畸形率，應(yīng)用MDA試劑盒檢測精子膜脂類過氧化反應(yīng)產(chǎn)物丙二醛，熒光染料吖啶橙標(biāo)記精子DNA

4、，熒光顯微鏡下檢測精子DNA損傷，熒光染料羅丹明(Rh123)標(biāo)記精子線粒體，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。annexinV-FITC試劑盒檢測精子凋亡變化。另外0.5ml精液冷凍復(fù)蘇后檢查前述指標(biāo)。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得志愿者知情同意。
　　 [結(jié)果]①正常精液組中：精子正常形態(tài)降低明顯、氧化應(yīng)激值(MDA)升高顯著、線粒體膜電位下降明顯、凋亡精子比率下降明顯、死亡精子比率升高顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②異常精液組中

5、：精子正常形態(tài)降低明顯、MDA升高顯著、DNA損傷率升高、線粒體膜電位下降明顯、活精子及凋亡精子比率下降明顯、死亡精子比率升高顯著，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③兩組之間的比較：冷凍造成異常精液組中精子正常形態(tài)損傷、DNA損傷明顯、死亡精子比率升高、凋亡精子比率下降均高于正常精液組，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④相關(guān)分析：凋亡精子AN+/PI-的比率與精子的密度呈正相關(guān)關(guān)系，精子的MMP和精子活動力(a+b)呈正相關(guān)關(guān)系，MDA值與DNA損傷率呈正相關(guān)。相