冷凍對(duì)人精子核DNA完整性的影響及抗氧化劑改善凍融人精子質(zhì)量的研究.pdf

1、前言
　　精液冷凍是輔助生育技術(shù)(ART)領(lǐng)域中的重要技術(shù)之一,發(fā)展至今已有200多年歷史。然而,凍融后的精液質(zhì)量仍不甚令人滿意。目前,凍融后精液質(zhì)量下降最直觀的表現(xiàn)是活力、活率的下降。此外,冷凍還可以造成精子頂體反應(yīng),精卵融合能力的下降。冷凍對(duì)精子遺傳物質(zhì)即核DNA損傷的研究目前尚無(wú)定論。而精子核DNA完整與否關(guān)系到父方遺傳物質(zhì)能否被準(zhǔn)確無(wú)誤地傳遞給子代。因此,本研究采用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù),分析冷凍復(fù)蘇過(guò)程對(duì)精子核DNA完整性的影響。

2、
　　冷凍復(fù)蘇過(guò)程可導(dǎo)致精液活性氧(reactive oxidative species,ROS)產(chǎn)生增加,使精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)(oxidative stress)從而損傷精子。本研究擬在冷凍精液中分別添加精漿中主要抗氧化物質(zhì)成分:抗壞血酸鹽(ascorbate)、過(guò)氧化氫酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),探討添加這些抗氧化物質(zhì)對(duì)凍融精子可能的保護(hù)作用。用計(jì)算機(jī)輔助精子分

3、析儀、流式細(xì)胞儀、彗星實(shí)驗(yàn)分析各實(shí)驗(yàn)組凍融后的精子活力(a+b％),ROS水平,線粒體膜電位(△Ψm),早期凋亡,核DNA完整性。
　　目的
　　1.分析冷凍復(fù)蘇過(guò)程對(duì)健康男性精子核DNA完整性的影響。
　　2.探討精液冷凍中添加上述幾種抗氧化物質(zhì):抗壞血酸鹽、catalase、SOD對(duì)凍融精子可能的保護(hù)作用。
　　方法
　　1.采用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù),分析冷凍復(fù)蘇過(guò)程對(duì)健康男性精子核 DNA完整性的影響。

4、>　　2.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組精液冷凍復(fù)蘇后的活性氧水平,線粒體膜電位水平,早期凋亡,結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助精液常規(guī)參數(shù)分析以及彗星實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)添加這幾種抗氧化物質(zhì)成分對(duì)凍融精子可能的保護(hù)作用。
　　結(jié)果
　　1.冷凍前原始精液彗星細(xì)胞率32.3±5.0%,冷凍復(fù)蘇后精液彗星細(xì)胞率32.5±5.0%,與冷凍前相比,差異無(wú)顯著性意義(t=1.975,P>0.05)。核DNA損傷指標(biāo):精子尾部DNA%(TD%)及Olive尾矩(Olive

5、 tail moment,OTM值)冷凍后與冷凍前相比明顯升高(48.2±6.3% vs39.1±7.1%,t=2.956, P<0.01;10.4±2.8 vs7.4±2.3,t=2.824,P<0.01)。
　　2.冷凍前原始精液 a+b級(jí)精子為:64.7±4.7%,凍融后各組 a+b級(jí)精子均比冷凍前下降(P<0.01),但抗壞血酸鹽300μM組與兩種濃度的CAT組 a+b級(jí)精子下降少于陰性對(duì)照組(分別為43.5±10.0%、

6、43.9±8.2%、44.3±9.4% vs38.1±7.9%,P<0.05、P<0.01、P<0.01);相對(duì)應(yīng)組的精子復(fù)蘇率也明顯高于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為67.2±14.1%、68.4±13.8%、68.8±14.8% vs58.8±10.1%,P<0.05、P<0.01、P<0.01)。而這三組ROS水平則分別低于陰性對(duì)照組(分別為29.6±12.8%、30.0±11.2%、30.1±11.0% vs36.7±1

7、7.0%,P<0.05、P<0.05、P<0.05);兩種濃度CAT組的△Ψm均高于對(duì)照組(分別為34.6±12.9%、32.9±11.2%vs27.5±10.8%,P<0.01、P<0.05);活的未出現(xiàn)凋亡(PI-Ann-%)的精子則抗壞血酸鹽300μM組、CAT200U組高于對(duì)照組(分別為14.0±3.8%、13.2±2.6%vs10.1±4.0%,P<0.01、P<0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)指標(biāo)與陰性對(duì)照組

8、相比差異無(wú)顯著性意義,P>0.05。
　　3.冷凍復(fù)蘇后各實(shí)驗(yàn)組彗星細(xì)胞率與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。添加抗壞血酸鹽300μM組,CAT200U組、400U組的核DNA損傷指標(biāo):TD%及 OTM值分別低于對(duì)照組(分別為41.0±4.2%、39.6±6.6%、40.1±6.2% vs46.1±5.6%,P<0.01、P<0.01、P<0.01;7.7±1.2、7.5±1.6、7.8±1.9 vs10.1±3.1,

9、P<0.01、P<0.01、P<0.01)。其余實(shí)驗(yàn)組上述指標(biāo)則與對(duì)照組之間差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。
　　4.冷凍復(fù)蘇后各實(shí)驗(yàn)組a+b級(jí)精子,對(duì)照組和抗壞血酸鹽600μM組、兩種濃度CAT組、SOD400U組的△Ψm,以及對(duì)照組和兩種濃度抗壞血酸鹽組、CAT200U組、SOD200U組的PI-Ann-%均分別與本組的ROS水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05、P<0.01)。除抗壞血酸鹽600μM組外,其余添加抗氧化劑組TD%、O

10、TM值則分別與其對(duì)應(yīng)組ROS有正相關(guān)性(P<0.05、P<0.01)。
　　結(jié)論
　　1.在慧星實(shí)驗(yàn)中,采用彗星細(xì)胞率來(lái)分析冷凍前后精液 DNA損傷情況,發(fā)現(xiàn)冷凍不會(huì)造成健康男性核DNA損傷精子比例的增多;而采用TD%、OTM指標(biāo)分析,則冷凍前已損傷的精子核DNA鏈冷凍后損傷程度增加。由此可見(jiàn),聯(lián)合采用彗星細(xì)胞率、TD%、OTM指標(biāo)能更全面地反映冷凍對(duì)人精子核DNA完整性的影響。
　　2.合適濃度抗壞血酸鹽、CAT作為