ATP7B重組真核表達質粒治療TX小鼠的實驗研究及Ad-ATP7B的構建.pdf

1、Wilson病(Wilson'sdisease，WD)，又稱為肝豆狀核變性(hepatolenticulardegeneration，HLD)，是一種常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。由于銅離子在體內蓄積造成肝臟和腦部為主的全身性病理損害。導致以肝臟和神經系統癥狀為主的復雜的臨床表現，以角膜色素環(huán)(Kayser-Fleischerring，K-F環(huán))最具特征性。其生化特征是血清銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)降低和膽道排銅障

2、礙。 WD是一種單基因遺傳病，據本科門診統計該病位居單基因遺傳病的第二位。WD致病基因定位于D13q14.3，外顯子全長為4398bp,編碼蛋白為P型ATP酶，多肽鏈長1465AA，命名為ATP7B?，F已明確WD基因全長約80Kb，含21個外顯子及20個內含子。 目前WD的治療方法包括：①金屬絡合劑為主的驅銅對癥治療，②鋅劑治療，③肝移植尤其原位肝移植治療。但這些治療方法均不甚理想，而WD作為單基因遺傳病，最理想的治療當

3、屬基因治療?；蛑委熓侵敢赃z傳學原理及基因工程技術為基礎，在基因水平修補，矯正，替代缺陷基因或調控其表達的治療方法。目前應用較多的單基因遺傳病基因治療載體是真核表達質粒和病毒載體。真核表達質粒具有構建相對簡單，可在細菌內快速大量擴增等優(yōu)點。腺病毒載體進入宿主細胞核后以附加體形式存在，不整合進宿主基因組，不存在隨機插入的不安全性問題，同時又能高效表達，故WD基因治療應用腺病毒載體或真核表達質粒較為合適。國內尚未開展WD的基因治療研究。

4、 Wilson病是我國單基因神經遺傳病研究得最深入的幾個病種之一。本課題組在梁秀齡教授帶領下于二十世紀八十年代初開始了對WD的系列研究。并首次在國內引進了目前常用的WD的動物模型-TX小鼠，該小鼠的遺傳背景已明確：其致病基因為atp7b，定位于第8號染色體，突變形式為Mel1356Val，該位點在第8跨膜區(qū)，其mRNA轉錄水平無明顯改變。編碼蛋白與人ATP7B蛋白的同源性為58％。也表現為肝內銅大量沉積、血清銅和銅藍蛋白水平下降等。

5、 本研究的目的和意義目前對WD的治療采用青霉胺等金屬絡合劑、鋅劑、低銅飲食等對癥治療，減少銅的攝入并促進其排出。由于這些只是對癥治療，故患者須終生治療，且青霉胺等金屬絡合劑常出現嚴重的毒副作用而使患者被迫中斷治療。而原位肝移植治療由于存在難以避免強烈的免疫排斥反應，供肝來源有限，治療費用昂貴等諸多問題，只能解決部分患者的治療問題。WD致病基因ATP7B的定位和克隆為WD的基因治療奠定了初步的基礎。本實驗在本課題組既往研究的基礎上

6、，在國內率先開展WD基因治療的初步研究和探討。鑒于ATP7BcDNA長達4.4kb，構建重組腺病毒難度較大，故先構建ATP7B重組真核表達質粒，進行離體和在體水平的基因治療研究探索，然后進行重組腺病毒的構建，為下一步重組腺病毒的基因治療創(chuàng)造條件。內容包括： 1.構建ATP7B基因的重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/ATP7B。 2.進行TX小鼠體外皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)并進行pcDNA3.1(+)/ATP7B在細胞水

7、平基因治療的初步研究。 3.以重組真核表達質粒pcDNA3.0/ATP7B進行TX小鼠基因治療的初步研究。4.構建ATP7B基因的重組腺病毒載體Ad-ATP7B。 第一章重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構建實驗方法 將pRC/CMV-ATP7B和pcDNA3.1(+)以XbaI和BamHI雙酶切后的ATP7BcDNA片段和線性化的pcDNA3.1(+)連接，定向克隆構建pcDNA3.1(+)/

8、ATP7B。挑取陽性克隆進行PCR鑒定和酶切鑒定。并進行ATP7BcDNA的全序列測序。 實驗結果PCR及酶切鑒定均證實重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構建成功。ATP7BcDNA的全序列測序發(fā)現3個錯義突變點，但造成的氨基酸改變不在ATP7B蛋白的高度保守區(qū)。 結論本研究對重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/ATP7B的構建獲得成功。第二章pcDNA3.1(+)/ATP7B對TX小鼠成纖維細胞模

9、型銅代謝影響實驗方法 先隨機選取4月齡的TX小鼠(WD動物模型)和DL小鼠(正常對照小鼠)各10只，雌雄比例相同。以腹部皮膚進行成纖維細胞的體外培養(yǎng)，測定其銅/蛋白比值(Cu/p，ng/mg)以確定TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細胞是否可作為WD細胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時轉染TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細胞，確定pcDNA3.1(+)/ATP7B的最適加入量和加入后細胞最佳收集時間。 再隨機選取4月

10、齡的TX小鼠20只，將其體外培養(yǎng)的成纖維細胞平行分成3組，一組加生理鹽水，另兩組分別加入pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/ATP7B。分別測定細胞Cu/P比值。 以TX小鼠體外培養(yǎng)的成纖維細胞制備細胞玻片，瞬時轉染pcDNA3.1(+)/ATP7B24h后取出玻片進行細胞免疫組化實驗，以轉染pcDNA3.1(+)和未轉染質粒者為對照組。 實驗結果10只TX小鼠和DL小鼠體外培養(yǎng)成纖維細胞細胞內銅蛋白比值(C

11、u/P)分別為(x±S)：(64.25±21.43)ng/mg、(38.43±16.24)ng/mg。前者明顯高于后者，二者相比較有顯著性差異(組間比較t=3.154，P＜0.01)，故TX小鼠的體外培養(yǎng)的成纖維細胞可作為WD的細胞模型。 pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時轉染后，加入1μgpcDNA3.1(+)/APT7B于24h收集細胞療效較佳。 TX小鼠體外培養(yǎng)成纖維細胞加入pcDNA3.1(+)/ATP7B后

12、，Cu/P比值較對照組顯著下降，P＜0.01。 細胞免疫組化實驗顯示，轉染pcDNA3.1(+)/ATP7B者表達ATP7B蛋白較轉染pcDNA3.1(+)和未轉質粒者表達顯著增強，陽性細胞的胞膜呈棕褐色。結論 TX小鼠離體培養(yǎng)成纖維細胞可作為WD的細胞模型。重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)/ATP7B瞬時轉染TX小鼠離體培養(yǎng)成纖維細胞后能夠表達并具有排銅作用。 第三章pcDNA3.0/ATP7B對TX小鼠

13、肝銅代謝和肝功能的影響實驗方法由于本課題研究中所構建的pcDNA3.1(+)/APT7B經對APT7BcDNA全序列測序發(fā)現3個錯義突變點，為進一步保證研究的結果可靠性，本實驗中采用了另一種ATP7B重組真核表達質粒(其APT7BcDNA序列正確)進行TX小鼠的基因治療研究。 本研究采用質粒和脂質體混合后進行尾靜脈注射的方式。分別給予pcDNA3.0/APT7B0、10、20、50、100、150μg，3d后測定其肝銅含量(ng

14、/mg，即每mg干重的肝組織中銅的含量)，確定合適的治療的劑量。 然后隨機選取36只TX小鼠，隨機分成3組，即注射生理鹽水組、注射pcDNA3.0組、注射pcDNA3.0/ATP7B組。進行肝臟組織RT-PCR、Westernblot檢測及肝銅含量測定。取血進行肝功能ALT測定。 實驗結果根據預實驗結果，取100μg/只為治療劑量。RT-PCR和Westernblot結果顯示，加入pcDNA3.0/ATP7B組于加入后第

15、3、7、14d均可見陽性條帶。但以加入第3d時最明顯。加入生理鹽水組和加入pcDNA3.0質粒組均未見陽性條帶。加入pcDNA3.0/APT7B組與生理鹽水組及pcDNA3.0組比較，于加入第3、7d肝銅含量和ALT均顯著下降，P值＜0.05，以第3天下降最明顯。加入第14d肝銅含量無顯著下降，P值＞0.05；ALT顯著下降，P值＜0.05。 結論ATP7B基因重組真核表達質粒pcDNA3.0/ATP7B對TX小鼠的銅代謝有改善

16、作用。 第四章重組腺病毒載體Ad-ATP7B的構建實驗方法分別以BamHⅠ+SalⅠ雙酶切pcDNA3.0/ATP7B和pDC315，將ATP7BcDNA目的基因片段和線性化的pDC315連接，定向克隆構建pDC315/ATP7B，以PCR和酶切鑒定。pDC315/ATP7B與腺病毒骨架共轉染293細胞構建Ad-ATP7B，PCR進行鑒定。 實驗結果經PCR和酶切鑒定證實pDC315/ATP7B構建成功。pDC315/A

17、TP7B與腺病毒骨架共轉染293細胞后見明顯的毒斑，說明二者在293細胞中同源重組并包裝成功。經PCR證實重組腺病毒載體Ad-ATP7B構建已完成。 結論本實驗成功構建了ATP7B外源目的基因序列完全正確的重組腺病毒載體Ad-ATP7B。 創(chuàng)新點1.首次構建了重組真核表達載體pcDNA3.1(+)/ATP7B，并以其轉染TX小鼠體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞在細胞水平進行WD基因治療研究。 2.首次以重組真核表達載體p