胱硫醚γ裂解酶-硫化氫通路失調(diào)在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥中的作用.pdf

1、目的:
　　研究胱硫醚γ裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)/硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)通路在氧化低密度脂蛋白(Oxidized LDL,ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥中的作用,并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　以Raw264.7細(xì)胞和小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,采用ox-LDL建立細(xì)胞炎癥模型。
　　采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcriptio

2、n-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及Western blot法檢測(cè)胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)變化;采用亞甲藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞外HS-濃度變化;采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CSE過(guò)表達(dá)及基因敲減的細(xì)胞模型;運(yùn)用不同的CSE抑制劑為工具藥抑制CSE活性;ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細(xì)胞間粘

3、附分子(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的生成和釋放;采用粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附;采用Western blot法檢測(cè)IκBα及磷酸化IκBα的表達(dá)、免疫熒光方法檢測(cè)NF-κB亞單位p65的亞細(xì)胞定位分布,結(jié)合ELISA法檢測(cè)胞核中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性;采用Western blot的方法檢測(cè)JNK、ERK、P38的磷酸化水平。
　　結(jié)果
　　RT-PCR結(jié)果顯示

4、正常培養(yǎng)條件下Raw264.7細(xì)胞僅表達(dá)CSE,而不表達(dá)胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,ox-LDL組CSE蛋白水平及mRNA水平均降低(p<0.05),且亞甲藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞外HS-濃度變化結(jié)果顯示ox-LDL作用后,原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及Raw264.7細(xì)胞胞外HS-濃度降低,提示ox-LDL抑制巨噬細(xì)胞CSE表達(dá)及H2S生成;

5、利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)及敲減CSE,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染載體組相比,CSE過(guò)表達(dá)組ox-LDL誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞TNF-α產(chǎn)生顯著減少(P<0.01),而CSE敲減則使TNF-α產(chǎn)生明顯升高(P<0.05);而用不同的H2S供體NaHS和Na2S預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)與ox-LDL組相比,預(yù)處理組TNF-α產(chǎn)生顯著降低,原代細(xì)胞結(jié)果也與此一致;NaHS預(yù)處理組ICAM-1生成和釋放亦減少;粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NaHS預(yù)處理組巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間

6、的粘附數(shù)減少;與H2S供體作用相類似,H2S合成底物cysteine預(yù)處理亦可顯著降低TNF-α生成,且該作用能被CSE抑制劑PAG和BCA逆轉(zhuǎn);Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示,ox-LDL能夠促進(jìn)IκBα、ERK及JNK磷酸化(P<0.01),并明顯促使p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位,而NaHS和Na2S能夠抑制IκBα及JNK磷酸化(P<0.05),且減少巨噬細(xì)胞核內(nèi)的p65水平。另外,RT-PCR結(jié)果顯示NF-κB、ERK、JN