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1、急性肺損傷(acute lunginjury,ALI)可由多種原因引起,主要病理特征為肺泡毛細(xì)血管膜和肺泡上皮廣泛受損而致的肺水腫和肺不張,臨床上可表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥,進(jìn)一步發(fā)展至呼吸衰竭即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。多種病因(包括肺內(nèi)/月市外,感染/非感染)都能直接或間接地引起 ALI及ARDS。革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖(1ipo
2、polysaccharide,LPS)是導(dǎo)致肺部感染和全身感染的主要因素。LPS由其受體介導(dǎo)啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),在肺部可表現(xiàn)為ALI。然而對(duì)于LPS啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致ALI的具體機(jī)制尚未完全闡明。 膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是一種典型的腦腸肽,它不但具有胃腸激素的功能,還以神經(jīng)遞質(zhì)
3、和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的形式發(fā)揮著重要的生理和病理生理作用。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)為內(nèi)源性CCK的重要功能片段。以往對(duì)CCK的研究多偏重于其在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等的調(diào)節(jié)作用。CCK-8 在肺臟也有分布。本室一直致力于研究CCK-8的抗內(nèi)毒素休克(endotoxinshock,ES)及抗炎作用。CCK的作用主要由兩種受體介導(dǎo),即CCK-A受體(CCK-A receptor,CC
4、K-AR)和CCK-B受體(CCK-B receptor,CCK-BR)。但有關(guān)CCK-8的抗炎作用及其機(jī)制尚未完全闡明,仍存在許多問題亟待解決。 內(nèi)源性氣體信號(hào)分子是一類具有多種生理和病理生理作用的生物物質(zhì),它們的發(fā)現(xiàn)為 ALI發(fā)病機(jī)制的研究開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。迄今已證實(shí)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子有三種,即一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化碳(carbon.monoxide,CO)和硫化氫(hydrogen sulf
5、ide,H<,2>S)。NO和CO在ALI中的作用已得到了證實(shí)。H<,2>S是繼NO和CO之后被確認(rèn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。它是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛-5’-磷酸依賴性酶[包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase,CB S)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)]等催化產(chǎn)生的。關(guān)于生理和病理情況下H<,2>S作用的研究雖剛剛起步,但己證實(shí)H<,2>S參與了神經(jīng)和血管
6、等的生理功能調(diào)節(jié),以及高血壓、肺動(dòng)脈高壓、內(nèi)毒素休克等疾病的發(fā)生。那么,探明H2S在LPS所致ALI中發(fā)揮何種作用,是本研究的主要目的之一。研究表明,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(lung microvascular endothelial cells,LMVEC)的活化和損傷在LPS所致的ALI中發(fā)揮重要作用。LPS介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜,但目前認(rèn)為L(zhǎng)PS—CD14-TLR4-IRAK-IKK—IkB-NF-NF-kB-proinfl
7、ammatory cytokines 是其中一條關(guān)鍵的信號(hào)通路,即LPS與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面LPS受體CD14結(jié)合后,激活Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)并與之結(jié)合形成受體復(fù)合物,募集適配分子MyD88,MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域再募集下游的IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor-associated kinase,IRAK)到受體復(fù)合物。IRAK隨后發(fā)生自磷酸化,從受體復(fù)合物解離,募集TNF受體
8、相關(guān)因子6(TNF receptor-associatedfactor 6,TRAF6),順次激活下游激酶,包括NF-kB誘導(dǎo)激酶(NF-kB-inducing kinase,NIK)和絲裂素活化蛋白激酶/ERK激酶激酶(mitogen-activated proteinkinase/ERK kinase kinase 1,MEKK1)。激活的NIK或MEKK1 都能獨(dú)自激活I(lǐng)KK復(fù)合物,導(dǎo)致IkB磷酸化降解,NF-kB移位入核,啟動(dòng)目
9、的基因轉(zhuǎn)錄。 CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中CSE表達(dá)有何作用,它是否通過調(diào)控CSE/H<,2>S來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用,以及TLR4/NF-kB通路是否參與CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的CSE表達(dá)的調(diào)控均未見報(bào)道。本研究在我室以往系列研究的基礎(chǔ)上,從整體、細(xì)胞及分子水平,觀察CCK-8對(duì)LPS所致的ALI及LMVEC損傷的改善作用,CCK受體(CCKreceptor,CCK-R)在LMVEC中的分布及表達(dá)變化,以及CCK-8對(duì)LP
10、S誘導(dǎo)的CSE/H<,2>S的影響及TLR4/NF-kB通路在此過程中的作用,以探討CSE/H<,2>S體系在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用,為臨床防治ALI提供新的對(duì)策。 1 內(nèi)、外源性H<,2>S在CCK-8減輕脂多糖所致急性肺損傷中的作用 本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察內(nèi)、外源性H<,2>S在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用。將84只雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(每組12只):①對(duì)照組:氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(
11、200μl·只<'-1>);②LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl<'-1>·只<'-1>);③NaHS+LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)腹腔注射0.5 mL NariS(28μmol·kg<'-1>);④PPG+LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)腹腔注射0.5 mL PPG(45μmol·kg<'-1>);⑤CCK-8+LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)舌靜脈注射CCK-8(40μg·kg<'-
12、1>);⑥PPG+CCK-8+LPS組:氣管內(nèi)滴注LPS前10 min先腹腔注射PPG(劑量同前),隨即舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前);⑦CCK-8組:氣管內(nèi)滴注生理鹽水前1 0 min經(jīng)舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前)。于給藥后4 h、8 h觀察。留取血漿以檢測(cè)H<,2>S含量。制備支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)以檢測(cè)其中中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear ne
13、utrophils,PMN)數(shù)目和蛋白含量。未進(jìn)行支氣管肺泡灌洗的動(dòng)物的動(dòng)物摘取全肺稱重并測(cè)定肺系數(shù),留取左肺葉中上部,用于制備肺組織勻漿以測(cè)定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性和P-選擇素(P-selectin,P-SLT)水平。10%中性甲醛固定左肺葉下部,常規(guī)石蠟包埋、切片,經(jīng)HE染色以觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行定量評(píng)價(jià)指標(biāo)(index ofquanti
14、tative assessment,IQA)的測(cè)定。 2 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致的急性肺損傷中的作用機(jī)制 3 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制 本實(shí)驗(yàn)旨在通過培養(yǎng)大鼠LMVEC,觀察H<,2>S在CCK-8減輕LPS所致LMVEC損傷中的作用及其機(jī)制以及CCK-R在LMVEC中的分布和表達(dá)的變化。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)從
15、整體、細(xì)胞和分子水平較為系統(tǒng)地觀察了CSE/H<,2>S 體系在CCK-8減輕LPS所致 ALI和LMVEC損傷中的作用,并探討了在此過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和受體機(jī)制,為其在臨床上應(yīng)用提供了新的、可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 氣管內(nèi)滴注LPS可引起明顯的肺組織損傷,同時(shí)血漿H<,2>S含量下降;抑制內(nèi)源性H<,2>S的產(chǎn)生,可加重LPS所致的 ALI,提示H<,2>S具有抗肺損傷作用,其機(jī)制可能與其抑制肺內(nèi)PMN聚集及由此引起的炎癥反
16、應(yīng)和氧化損傷有關(guān)。CCK-8可減輕肺損傷的同時(shí)上調(diào)血漿H<,2>S含量。CCK-8細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮與內(nèi)源性H<,2>S生成之間可能具有某種內(nèi)在聯(lián)系。 2 CCK-8通過上調(diào)CSEmRNA表達(dá)和CSE蛋白活性增加而發(fā)揮肺保護(hù)作用。并在整體和細(xì)胞水平證實(shí)CCK-8上調(diào)CSE表達(dá)可能是通過NF-kB 信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控的。在這一過程中,NF-kB對(duì)TLR4 可能存在重要的的調(diào)節(jié)作用。H<,2>S可上調(diào)ALI大鼠肺組織CCKA/B R的
17、表達(dá)。 3 在培養(yǎng)的LMVEC水平,CCK-8也可減輕LPS的損傷作用,此作用可能由CCK-R介導(dǎo),通過上調(diào)LPS所致大鼠LMVEC CSEmRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的;同時(shí)提示LMVEC在CCK-8減輕LPS所致ALI中發(fā)揮重要作用。 4 首次發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的LMVEC上存在CCK-BR。LPS作用下,CCK-BRmRNA表達(dá)上調(diào),是內(nèi)源和外源性CCK-8 發(fā)揮其改善LPS損傷作用和調(diào)控CSE/H<,2>S體系的重要受體機(jī)制。
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