FOXD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤體外生物學(xué)行為的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分FOXD3基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中的表達(dá)
　　目的：構(gòu)建攜帶有外源性人FOXD3基因的真核表達(dá)載體,并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞株,觀測(cè)瘤細(xì)胞中FOXD3過(guò)表達(dá),為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　方法：運(yùn)用基因工程方法構(gòu)建FOXD3真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞株,兩種細(xì)胞系均分為三組,即空白對(duì)照組(control)、空白質(zhì)粒組(pl

2、asmidnegativecontrol,PNC)及目的質(zhì)粒組(FOXD3+),采用熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率,運(yùn)用westernblot和real-timePCR方法檢測(cè)瘤細(xì)胞中FOXD3蛋白和mRNA過(guò)表達(dá)水平。
　　結(jié)果：構(gòu)建了FOXD3基因的真核表達(dá)載體;兩種細(xì)胞系空白對(duì)照組均無(wú)熒光,PNC及FOXD3+組細(xì)胞均有綠色熒光,且兩組熒光亮度及密度相近,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析轉(zhuǎn)染效率達(dá)70％-85%。兩種細(xì)胞系空白對(duì)照組和PNC組FOXD

3、3蛋白及mRNA的表達(dá)水平低下,SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞的FOXD3+組FOXD3蛋白表達(dá)水平較PNC組分別升高5.78倍(P<0.05)、6.39倍(P<0.05),FOXD3mRNA表達(dá)水平分別增高20.362倍(P<0.05)、23.652倍(P<0.05)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了FOXD3基因的真核表達(dá)載體,能介導(dǎo)FOXD3基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞株中過(guò)表達(dá),為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

4、r>　　第二部分FOXD3基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　目的：探討FOXD3基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
　　方法：神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞均分為空白對(duì)照組(control)、空白質(zhì)粒組(plasmid negative control,PNC)及目的質(zhì)粒組(FOXD3+),轉(zhuǎn)染48h后運(yùn)用MTT、EdU、克隆形成、軟瓊脂實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖,采用AnnexinV

5、-碘化丙錠(PI)雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：在SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞中,各自的PNC組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞增殖率無(wú)顯著性差異(P>0.05),而FOXD3+組與PNC組相比增殖率均有明顯下降。MTT比色法顯示SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞增殖率分別下降了31.7%(P<0.05)、26.9%(P<0.05);EdU摻入法顯示SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞增殖率分別下降了28.4%(P<0.05)、

6、24.3%(P<0.05);克隆形成、軟瓊脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與各自的PNC組相比,FOXD3+組形成的單克隆細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少,且細(xì)胞團(tuán)或細(xì)胞球的直徑顯著減小。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,SK-N-SH及SK-N-MC的PNC組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P>0.05),而FOXD3+組細(xì)胞凋亡率分別升高了1.7倍(P<0.05)、1.5倍(P<0.05)。
　　結(jié)論：FOXD3基因過(guò)表達(dá)可顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH

7、及SK-N-MC細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡。
　　第三部分FOXD3基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲遷移、血管生成的影響
　　目的：探討FOXD3基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲遷移、血管生成的影響。
　　方法：神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞均分為空白對(duì)照組(control)、空白質(zhì)粒組(plasmidnegativecontrol,PNC)及目的質(zhì)粒組(FOXD3+),轉(zhuǎn)染48h后運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)

8、檢測(cè)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力;運(yùn)用培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),觀察其小管形成能力;運(yùn)用real-timePCR和westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞中N-myc及其下游基因NDRG1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞轉(zhuǎn)染FOXD3基因48h后,與空白對(duì)照組相比,PNC組細(xì)胞侵襲遷移能力無(wú)顯著變化(P>0.05),而FOXD3+組細(xì)胞侵襲遷移能力分別下降了34.3%(P<0.

9、05)、29.4%(P<0.05);與PNC組相比,FOXD3+組細(xì)胞血管生成能力顯著下降,生成血管的直徑較小且成環(huán)率降低;與空白對(duì)照組相比,PNC組瘤細(xì)胞N-myc及NDRG1的mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05),而FOXD3+組細(xì)胞N-mycmRNA表達(dá)水平分別下降26.2%(P<0.05)、24.1%(P<0.05),而NDRG1的mRNA表達(dá)水平分別上升約1.8倍(P<0.05)、1.7倍(P<0.05);westernbl

10、ot檢測(cè)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,PNC組瘤細(xì)胞N-myc及NDRG1蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05),FOXD3+組細(xì)胞N-myc蛋白表達(dá)分別下降22.3%(P<0.05)、20.8%(P<0.05),而NDRG1蛋白表達(dá)分別升高1.5倍(P<0.05)、1.4倍(P<0.05)。
　　結(jié)論：FOXD3基因過(guò)表達(dá)能顯著降低SK-N-SH及SK-N-MC細(xì)胞的侵襲遷移及血管生成能力,抑制其轉(zhuǎn)移,其可能機(jī)制是通過(guò)下調(diào)N-myc表