DHV-Ⅰ對(duì)鴨巨噬細(xì)胞TLRs信號(hào)通路的影響.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duckviralhepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(Duckhepatitisvirus,DHV)引起的鴨類傳染病,DHV分為DHV-Ⅰ型、DHV-Ⅱ型、DHv-Ⅲ型和新型DHV。DHV-Ⅰ型病毒入侵機(jī)體后能迅速?gòu)?fù)制,并能突破血腦屏障引起雛鴨急性死亡。研究表明,干擾素(Interferon,IFN)和白介素(Interleukin,IL)能抑制病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制,而Toll樣受體7(Toll-likerecept

2、or7,TLR7)通過(guò)識(shí)別病毒ssRNA激活依賴MyD88信號(hào)通路,活化免疫細(xì)胞而釋放Ⅰ型IFN、IL-6、IL-12等細(xì)胞因子,起到抵御病毒的入侵及復(fù)制作用。已有試驗(yàn)表明,通過(guò)上調(diào)TLR7的表達(dá)可以抑制ssRNA病毒如丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)[1]、呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)[2]及兩尼羅河病毒(Westnilevirus,WNV)[3]在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制,但

3、目前尚未見(jiàn)有關(guān)于DHV-Ⅰ型病毒感染對(duì)TLRs信號(hào)通路影響的研究報(bào)道。
　　 本研究通過(guò)分析鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因在雛鴨體內(nèi)組織的分布情況,檢測(cè)在DVH-Ⅰ感染鴨巨噬細(xì)胞0h、2h、8h、24h和32h時(shí),TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA表達(dá)量,并用RNAi技術(shù)沉默鴨TLR7基因表達(dá),擬探討DHV-I對(duì)TLRs信號(hào)通路的影響,了解機(jī)體對(duì)DHV-I的識(shí)別及所引起炎

4、癥反應(yīng)的機(jī)制,為進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs信號(hào)通路來(lái)防治DHV-I感染提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因組織表達(dá)及序列分析
　　 參照NCBI公布序列設(shè)計(jì)鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α的特異性引物,建立RT-PCR檢測(cè)TLR7、MyD88等5種免疫信號(hào)通路關(guān)鍵分子的mRNA在鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和法氏囊7個(gè)組織中的表達(dá)?；蚪M織

5、表達(dá)圖譜顯示,在鴨7個(gè)組織中均檢測(cè)到TLR7、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;而MyD88在腎和腦組織中未見(jiàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,但在其他組織中有表達(dá)。本試驗(yàn)檢測(cè)到鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因主要分布于外周免疫器官,這可能是因這些基因參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和炎癥過(guò)程。迄今,尚未見(jiàn)有鴨MyD88與NF-kB基因序列的報(bào)道,對(duì)本試驗(yàn)克隆到的鴨MyD88和NF-kB部分基因進(jìn)行測(cè)序并用BLAST比較相似性。結(jié)果

6、顯示,鴨MyD88、NF-kB基因序列與雞、珍珠鳥(niǎo)等禽鳥(niǎo)類的相似性在90%左右,與人、鼠的相似性在80%左右;對(duì)核酸序列推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行的同源性比較發(fā)現(xiàn),鴨MyD88、NF-kB與雞、珍珠鳥(niǎo)等禽鳥(niǎo)類同源性最高,均為97%～100%;而鴨MyD88與人、鼠的同源性均為84%,鴨NF-kB與人、鼠的同源性分別為36%、34%。這表明,不同物種間的MyD88部分基因具有保守性,而NF-kB部分基因的保守性不高。
　　 2.DVH-I

7、對(duì)鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA表達(dá)量影響
　　 通過(guò)CFXManager1.6軟件對(duì)本試驗(yàn)建立的鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α引物建立其SYBRGreenI熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行分析,得出本法中TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因產(chǎn)物分別在80℃、85℃、83.5℃、91.5℃、82℃出現(xiàn)單特異性峰,基因擴(kuò)增分別為102.2%、101.

8、9%、99.4%、105.1%、94.4%,相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.993、0.999、0.997、0.989,均符合建立熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的檢測(cè)鴨TLR7、MyD88等基因的熒光定量RT-PCR的特異性高。用所建立的熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)DHV-I感染鴨原代巨噬細(xì)胞2h、8h、24h和32h時(shí)的TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA相對(duì)表達(dá)量,并用duncan法分析組問(wèn)的差異

9、。結(jié)果顯示,鴨TLR7和NF-kBmRNA表達(dá)量在DHV-I感染細(xì)胞8h至24h間迅速升高;MyD88、IL-6和IFN-αmRNA表達(dá)量在感染2h至8h間無(wú)明顯變化,在感染24h時(shí)明顯升高,表明DHV-I能誘導(dǎo)鴨巨噬細(xì)胞上調(diào)TLR7的表達(dá)并增加IFN-α、IL-6的表達(dá)。TLR7、MyD88、NF-kB和IL-6mRNA表達(dá)量在感染32h時(shí)均顯著下調(diào),推測(cè)是由于TLR7表達(dá)量的成倍增加啟動(dòng)細(xì)胞TLRs信號(hào)通路負(fù)調(diào)控機(jī)制,降低整體信號(hào)通

10、路分子基因表達(dá)。
　　 3.RNAi沉默TLR7對(duì)鴨巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響
　　 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)一對(duì)與靶基因無(wú)同源性的熒光標(biāo)記陰性對(duì)照siRNA,在Lipofectamine2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染鴨原代巨噬細(xì)胞,優(yōu)化RNAi實(shí)驗(yàn)所需轉(zhuǎn)染試劑計(jì)量和siRNA濃度。發(fā)現(xiàn)采用Lipofectamine2000計(jì)量(1.0μl)與siRNA濃度(50pmol)能達(dá)到約75%的轉(zhuǎn)染效率。針對(duì)鴨TLR7基因設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)siRNA(s

11、iRNA500、siRNA1681、siRNA2957)分別進(jìn)行RNAi試驗(yàn),采用SYBRGreenI熒光定量RT-PCR檢測(cè)TLR7mRNA表達(dá)量,比較其抑制率,篩選能有效抑制TLR7表達(dá)的siRNA。結(jié)果表明:siRNA1681能有效沉默巨噬細(xì)胞內(nèi)鴨TLR7基因mRNA的表達(dá),使TLR7mRNA表達(dá)量減少了約71%,符合siRNA轉(zhuǎn)染后應(yīng)干擾70%mRNA表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)。采用siRNA1681沉默TLR7基因表達(dá),檢測(cè)在DHV-I感