Rab蛋白調(diào)控巨噬細胞中TLR9信號轉(zhuǎn)導通路的研究.pdf

1、TLRs是一類重要的模式識別受體，天然免疫細胞通過識別病原微生物中保守的病原體相關(guān)分子模式，產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，啟動天然免疫應(yīng)答，從而構(gòu)成了機體免疫反應(yīng)的第一道防線。然而，TLRs的活化異常或者過分活化，可能使自身免疫疾病惡化，產(chǎn)生如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、內(nèi)毒素休克和自身免疫等疾病。因此，TLRs信號通路的活化必須得到嚴密控制。目的：構(gòu)建 Rab5a和Rab9真核表達載體，建立穩(wěn)定表達 Rab5a及其突變體 Rab5aN133I的巨噬細胞

2、系，研究 Rab5a及其突變體、Rab7及其突變體過表達后對 CpG刺激的巨噬細胞中細胞因子的影響。方法：以小鼠巨噬細胞 RAW264.7的cDNA為模板，根據(jù) GenBank中公布的小鼠 Rab5a和Rab9全長序列設(shè)計引物，擴增 Rab5a和Rab9的開放閱讀框，并與真核表達載體pcDNA3.1/Flag(–)B連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆，酶切鑒定后測序。通過脂質(zhì)體法將Rab5a及其突變體 Rab5aN133I的真核表達載體轉(zhuǎn)染到 R

3、AW264.7細胞中，用G418選擇性培養(yǎng)基進行篩選，建立穩(wěn)定表達 Rab5a、Rab5aN133I的細胞系。通過 RT-PCR，Real time-PCR和Western Blot方法鑒定穩(wěn)定表達的細胞系。用CpG刺激穩(wěn)定表達Rab5a、Rab5aN133I、Rab7及 Rab7T22N的細胞系8小時后檢測細胞因子的表達量變化。結(jié)果：將Rab5a和Rab9的陽性克隆測序后與 GeneBank中報道序列的同源性為100％和99％，均不存

4、在突變。RAW264.7轉(zhuǎn)染 Rab5a和Rab7真核表達載體后 Rab5a和Rab7的表達量明顯高于對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。Rab5a過表達后，在 CpG的刺激作用下巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-1β和IFN-β明顯升高，而 Rab5aN133I過表達后上述細胞因子的分泌均有所恢復。CpG刺激過表達 Rab7的細胞，其分泌的IL-6、IL-1β及 IFN-β顯著降低，而 Rab7T22N過表達后卻促進了上述細胞因子的增殖。結(jié)論：成功構(gòu)建