重組人CYP2C9，CYP2C19及其相關SNP酵母表達體系的構建和其在藥物抑制篩選中的初步研究.pdf

1、CYP2C9，CYP2C19作為細胞色素P450家族的重要組成部分，在藥物代謝過程中擔任重要作用，據(jù)統(tǒng)計大約有20％臨床用藥被CYP2C家族代謝，但由于二者都是多態(tài)性顯著的酶，在臨床用藥時往往會引發(fā)一系列藥物不良反應和藥物相互作用，因此對其基因多態(tài)性的研究就顯得頗為重要。 本研究采用體外重組技術，克隆、表達了CYP2C9，CYP2C19野生株及其相應的5個SNPs(CYP2C9—R144C，CYP2C9-1359L，CYP2C1

2、9—S51G，CYP2C19—R329H，CYP2C19—R442C)，建立了一個體外表達重組CYP2C9，CYP2C19酶的酵母體系，并且利用這個體系表達的多態(tài)性酶對其進行酶學分析和藥物抑制高通量實驗，測得Km，Vmax，Clint以及半數(shù)抑制常數(shù)IC50，從而藥物相互作用的預測和新藥的研究開發(fā)提供了理論依據(jù)。 1.通過定點突變PCR的方法，在野生株的cDNA上引入突變位點，并將其與酵母表達載體pYES2/CT連接，經(jīng)測序驗證

3、，電轉入已經(jīng)整合了細胞色素P450氧化還原酶基因(POR)的釀酒酵母細胞，利用半乳糖誘導目的蛋白的表達，經(jīng)western blot驗證，目的蛋白在55KD處有清晰的條帶出現(xiàn)，與預期大小相同，說明目的蛋白能夠表達。隨后大量誘導表達目的蛋白并使用bead beater裂解器裂解得酵母微粒體，經(jīng)BSA標準曲線換算出制備的微粒體濃度后，通過CO還原示差光譜法檢測，計算微粒體蛋白中P450的含量，結果如下： CYP2C9—WT30 pmol/mg

4、，CYP2C9—R144C60pmol/mg，CYP2C9—B59L8 pmol/mg，CYP2C19—WT30pmol/mg，CYP2C19—R329H53pmol/mg，CYP2C19—R442C27pmol/mg，CYP2C19—S51G未能計算出含量。 2.通過FDA公布的方法，使用探針底物通過HPLC驗證體系的可行性，得到的Km值與FDA公布的數(shù)值比較，結果符合FDA的要求，并且與其他文獻報道的使用相同體系獲得的數(shù)據(jù)接

5、近；另外，對制備的酵母微粒體的各項指標進行了考察，以保證實驗的準確度，包括制備的酶活性與人肝微粒體的比較，制備的酶的穩(wěn)定性研究，結果發(fā)現(xiàn)制備的酶穩(wěn)定性可以滿足實驗所需，在冰浴中可以保存6小時，且反復凍融不影響其活性，但經(jīng)過與人肝微粒體活性比較，發(fā)現(xiàn)其活性略低，但結果在本實驗能夠接受的范圍之內，也證明了酵母表達體系的可靠性以及所得數(shù)據(jù)的真實性。 3.利用制備的酵母微粒體，進行相應的酶學分析。(1)分別使用探針底物與熒光底物對位點突

6、變引起的酶活性變化進行檢測，(CYP2C9探針底物雙氯氛酸，熒光底物BOMCC；CYP2C19探針底物S—美芬妥英，熒光底物CEC)結果顯示，各位點的突變都不同程度的降低了CYP酶的活性，且CYP2C9-1359L和CYP2C19—R442C突變針對熒光底物和探針底物降低的程度不等。(2)同樣使用探針底物和熒光底物對制備的酵母微粒體進行酶動力學研究，檢測各個突變株的Km，Vmax以及Clint，結果顯示：不論針對探針底物還是熒光底物，各

7、個突變株的Km均增大，Clint均下降，而Vmax變化差異較大。在探針底物實驗中，與CYP2C9野生型相比，其突變株R144C和，I359L的Km分別增加了大約一倍和三倍，Clint分別為變化不大和下降了75％左右；與CYP2C19野生型相比，其突變株R329H，R442C的Km分別增加了三倍和略有增加，Clint分別下降了80％和95％，在熒光底物實驗中，CYP2C9—R144C的Km比野生型增加了一倍，Clint下降了25％左右，C

8、YP2C19—S51G，R329H，R442C與野生型相比，Km都增大了一倍左右，Clint分別下降了30％，60％和30％。(3)利用熒光底物對8類22種藥物進行高通量抑制實驗，底物選取Km附近的濃度，藥物作為抑制劑稀釋成一系列的濃度，利用熒光檢測技術測定抑制劑的半數(shù)抑制常數(shù)IC50，其中也包括CYP2C9和CYP2C19已知的特異性抑制劑，結果表明：CYP2C9特異性抑制劑磺胺苯比唑的IC50為0.7，CYP2C19特異性抑制劑反苯

9、環(huán)并胺IC50值為7.1，均與FDA公布的數(shù)值接近，也說明了該方法的可行性。其他抑制劑對制備的微粒體的抑制程度各不相同，化學結構或治療作用類似的同類藥品對CYP2C9，CYP2C19的抑制情況不一；不同基因型被同一種藥物抑制程度也不盡相同，甚至差別較大。 本實驗成功地建立了重組人CYP2C9，CYP2C19及其相應SNP的酵母表達系統(tǒng)，初步建立了對CYP2C9，CYP2C19多態(tài)性重組酶進行酶動力學檢測和藥物抑制作用的體外檢測技