SiRNA靶向Her-2基因對卵巢癌細胞株SKOV3生物學行為影響的研究.pdf

1、背景:盡管現(xiàn)代醫(yī)學已經(jīng)取得了巨大的進步，但是卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。人類基因組圖譜的繪制以及人類基因組研究的蓬勃興起，為從源頭上防治惡性腫瘤提供了新的途徑。近期的大量研究表明，人類基因組中與細胞增殖分化相關癌基因的激活和抑癌基因的失活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，在此基礎上出現(xiàn)了對惡性腫瘤進行基因治療的理論和實踐探索。尋找和確定有治療意義的目的基因是實施腫瘤基因治療的前提。RNA干擾(RNA interfefing,R

2、NAi)是一種由長約21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)引起的轉錄后基因沉默，以序列特異的方式抑制同源基因的表達，其副作用小，特異性高。RNAi是生物界普遍存在的一種調(diào)控基因表達的有效方式和鑒定基因功能的重要手段，具有高效特異阻斷基因表達的特點，在基因功能研究、信號轉導通路研究以及基因治療中得到廣泛的應用。近年來，小分子干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)

3、在腫瘤基因治療方面取得了重大進展。通過向腫瘤細胞內(nèi)導入能穩(wěn)定表達siRNA分子的質(zhì)粒或病毒載體來研究特定癌基因或抑癌基因的功能。 Her-2基因又稱C-erbB-2，其編碼的蛋白產(chǎn)物p185該蛋白產(chǎn)物在人類腫瘤中因基因擴增或轉錄異常而導致過度表達，是表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)亞群的成員之一，對腫瘤細胞的生長、分化起著重要的作用，且與腫瘤的化療敏感性呈顯著的負相關。

4、我們設想通過RNAi在轉錄水平上實現(xiàn)對卵巢癌細胞中Her-2表達水平的調(diào)控，觀察該方法對卵巢癌細胞生物學特征的影響，從而為將來該方法在臨床上的應用提供理論和實驗依據(jù)。 目的: 探討利用逆轉錄病毒載體介導的siRNA能否有效的介導腫瘤細胞出現(xiàn)RNAi現(xiàn)象，觀察其對Her-2基因表達的抑制作用和對人卵巢癌細胞株SKOV3生物學行為的影響。 方法: ①設計、構建及鑒定Her-2/siRNA、Her-2/siRN

5、A-negative重組逆轉錄病毒表達載體。 ②Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重組載體在脂質(zhì)體介導下轉染到包裝病毒細胞株PT67中，嘌呤霉素篩選并挑選細胞克隆。收獲的病毒上清液轉染人卵巢癌細胞株SKOV3，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉染的細胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative。通過RT-PCR和免疫組化方法鑒定Her-2表達的抑制效果。 ③通過MTT檢測細胞

6、增殖以及對順鉑的敏感性，通過流式細胞儀檢測細胞周期、細胞凋亡。 ④將穩(wěn)定轉染的細胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative及SKOV3種植到裸鼠皮下檢測成瘤情況，并觀察NK-92細胞對其殺傷作用。 結果: ①成功構建Her-2/siRNA、Her-2/siRNA-negative重組逆轉錄病毒表達載體。 ②建立了穩(wěn)定抑制Her-2基因表達的細胞株SKOV3/siRNA和對照組SK

7、OV3/siRNA-negative，SKOV3/siRNA組細胞Her-2基因表達為對照組的38.4％，免疫組化結果顯示Her-2基因表達受到較強抑制。 ③SKOV3/siRNA細胞株的G0/G1期細胞占(68.6±10.3)％，S期細胞占(15.1±1.2)％，G2/M期占(11.4±1.4)％；而SKOV3/siRNA-negative細胞株的G0/G1期細胞則占(55.8±9.1)％， S期細胞占(23.3±1.5)％，

8、G2/M期占(18.1±1.7)％。 ④SKOV3/siRNA細胞株早期凋亡(10.500±0.250)％、SKOV3/siRNA-negative細胞株早期凋亡(0.340±0.010)％，兩者比較，差異有顯著性(p<0.01)。 ⑤MTT檢測結果顯示SKOV3/siRNA組細胞增殖較SKOV3/siRNA-negative明顯下調(diào)(p<0.05)，接種于裸鼠皮下的腫瘤生長明顯減慢(p<0.01)。 ⑥對順鉑的

9、耐藥性研究：在DDP作用下SKOV3/siRNA細胞存活率在4d時為(66.4±3.3)％，與對照組(81.7±1.3)％比較差異有顯著性(p<0.05)。FCM分析顯示SKOV3/siRNA細胞的DDP誘導凋亡率為(42.84±1.4)％，明顯高于對照組組(8.8±0.7)％，差異有顯著性(p<0.01)。 ⑦NK細胞殺傷的研究：NK-92在效靶比1:20時對SKOV3/siRNA-negative、SKOV-3/siRNA細

10、胞殺傷率分別為(21.1±6.8)％和(45.5±8.9)％(p<0.05)，SKOV-3/siRNA細胞接種在裸鼠皮下形成的腫瘤生長速度慢于SKOV3/siRNA-negative (p<0.05)，在NK-92治療后其腫瘤生長速度顯著減慢(p<0.05)。 結論: ①由逆轉錄病毒載體介導的siRNA可以有效抑制Her-2基因的表達。 ②抑制卵巢癌細胞株SKOV3細胞的Her-2基因表達后，卵巢癌細胞株SKOV

11、3惡性生物學行為明顯受抑。 ③抑制卵巢癌細胞株SKOV3細胞的Her-2基因表達后，卵巢癌細胞株SKOV3對順鉑的敏感性增加。 ④抑制卵巢癌細胞株SKOV3細胞的Her-2基因表達后，可以增強NK-92細胞對SKOV3細胞在體內(nèi)和體外的殺傷活性。因此，抑制Her-2基因的表達可以影響卵巢癌細胞株SKOV3的惡性生物學行為，提高順鉑藥物敏感性，提高NK-92細胞的殺傷活性，NK-92細胞聯(lián)合靶Her-2基因的siRNA有望