靶向Livin的microRNA干擾對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3體外作用的研究.pdf

1、目的:研究靶向Livin的microRNA干擾對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌細(xì)胞SKOV3的體外作用。構(gòu)建兩個(gè)microRNA干擾序列連接到質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Livin mRNA的表達(dá)變化以及細(xì)胞增殖、凋亡和周期的改變。探討針對(duì)凋亡抑制基因Livin的靶向治療對(duì)卵巢癌逆轉(zhuǎn)的可行性,為卵巢癌靶向性治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外復(fù)蘇、培養(yǎng)并連續(xù)傳代人卵巢漿液

2、性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞,并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。
　　 2.設(shè)計(jì)合成特異性靶向Livin基因的microRNA序列,并連接到質(zhì)粒載體,該載體表達(dá)綠色熒光。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和熒光細(xì)胞數(shù),以判斷轉(zhuǎn)染的效率。
　　 3.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Livin mRNA表達(dá)水平的變化。
　　 4.采用四甲基

3、偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)microRNA干擾對(duì)SKOV3細(xì)胞體外生長(zhǎng)的增殖抑制作用。
　　 5.采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)microRNA干擾對(duì)SKOV3細(xì)胞周期分布及凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.光鏡與熒光顯微鏡顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后24h,對(duì)照組培養(yǎng)基清亮,細(xì)胞生長(zhǎng)密集,光澤度好;轉(zhuǎn)染組細(xì)胞密度較對(duì)照組低,光澤度下降,熒光顯微鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。轉(zhuǎn)染后48h,對(duì)照

4、組細(xì)胞已有重疊生長(zhǎng),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞貼壁率下降,貼壁細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光,熒光細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)70％-80％,證明轉(zhuǎn)染成功。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后48h,對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組的Livin mRNA兩個(gè)亞基條帶與內(nèi)參條帶灰度值比。Livinα在對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.58±0.21％、0.53±0.06％,在實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為0.36

5、±0.06％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組灰度比值明顯小于對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。Livinβ在對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組灰度比值分別為0.75±0.10％、0.73±0.15％,在實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為0.48±0.20％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組灰度比值明顯小于對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。以上結(jié)果顯示Livin mRNA的α與β兩個(gè)亞基在轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯減弱。表明靶向Livin基因的microRNA

6、干擾對(duì)于人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞具有可行性。
　　 3.四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)結(jié)果顯示:以陰性轉(zhuǎn)染組、實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組的抑制率相比較,靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后24h,陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為2.44±0.78％,而實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為30.37±2.17％,組間比較差異有顯著性(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后48h,陰性轉(zhuǎn)染組抑制率為2.54±0.30％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為46.49±3.36％,組間比較差

7、異有顯著性(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后72h,陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為3.33±0.20％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為55.26±2.69％,組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后24h到72h細(xì)胞抑制率呈增高趨勢(shì),說(shuō)明microRNA干擾對(duì)SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響呈一定的時(shí)間依賴(lài)性。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果顯示:靶向Livin的microRNA轉(zhuǎn)染后48h,對(duì)照組無(wú)明顯凋亡峰出現(xiàn),各轉(zhuǎn)染組在細(xì)胞周期G1期前出現(xiàn)了亞二倍

8、體凋亡峰且S期細(xì)胞比例下降,G0/G1期細(xì)胞比例上升,凋亡率增高。對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為1.26±0.19％、5.57±0.21％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為17.44±1.41％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組,組間比較差異有顯著性(P＜0.05);對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖指數(shù)分別為76.97±2.80％、69.20±2.26％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組為53.47±2.51％,實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于對(duì)照組及陰性轉(zhuǎn)染組,

9、組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。表明microRNA干擾對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.設(shè)計(jì)并合成了靶向Livin的microRNA序列,經(jīng)質(zhì)粒連接、脂質(zhì)體介導(dǎo)可成功轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞。
　　 2.靶向Livin的microRNA干擾能下調(diào)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞中Livin mRNA的表達(dá)。從而為microRNA在RNAi及基因

10、靶向治療的可行性方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3.靶向Livin的microRNA干擾對(duì)人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞的體外增殖具有明顯抑制作用,且具有一定的時(shí)間依賴(lài)性。
　　 4.靶向Livin的microRNA干擾能將人卵巢漿液性乳頭狀腺癌SKOV3細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,影響腫瘤細(xì)胞DNA的合成;并造成細(xì)胞周期G1期前明顯的亞二倍體凋亡峰的出現(xiàn),說(shuō)明其在抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的同時(shí)尚能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。