LRP16基因調(diào)控LPS-TLR4信號(hào)通路的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討人白血病相關(guān)蛋白16（LeukemiaRelatedProtein16，LRP16）調(diào)控LPS/TLR4信號(hào)通路的作用與機(jī)制研究。
　　方法：
　　(1).建立抑制或過表達(dá)LRP16基因的3T3-L1穩(wěn)定細(xì)胞系
　　a.將3T3-L1細(xì)胞按80％密度接種于6cm培養(yǎng)皿中，24h后按lipofectamine2000說明書將pcDNA-3.1-16和pcDNA-3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h后更換為含800μg/mlG

2、418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選3周，以后用含400μg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)LRP16細(xì)胞系3T3-L1-16及對(duì)照細(xì)胞系3T3-L1-3.1。用WesternBlot的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　b.針對(duì)已經(jīng)篩選確定的含有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的LRP16基因的siRNA靶序列合成OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與pENTR/U6載體連接產(chǎn)生LV-siLRP16慢病毒載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取重組陽性菌

3、落進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。將LV-siLRP16及包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生慢病毒顆粒，運(yùn)用Q-RCR檢測(cè)病毒滴度。將慢病毒顆粒感染3T3-L1細(xì)胞后用4μg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin)進(jìn)行抗性篩選3周，以后用含2μg/mlBlasticidin的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。構(gòu)建抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞系3T3-L1-374及對(duì)照細(xì)胞系3T3-L1-GFPi。用WesternBlot的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
　　(2).L

4、RP16對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞LPS/TLR4信號(hào)通路的影響
　　a.收集不同濃度LPS刺激后4、8、12、24h細(xì)胞蛋白，WesternBlot法檢測(cè)LRP16蛋白表達(dá)水平；
　　b.抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374及對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi加入1μg/mlLPS刺激60min，用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6mRNA及蛋白表達(dá)；
　　c.W

5、esternBlot檢測(cè)LRP16對(duì)無LPS刺激，上述受體的蛋白表達(dá)；d.WesternBlot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)；
　　e.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-6蛋白水平。
　　(3).LRP16對(duì)LPS誘導(dǎo)下MAPK信號(hào)通路的影響
　　用1μg/mlLPS刺激脂肪細(xì)胞60min，收集細(xì)胞蛋白，Westernblot檢測(cè)抑制或過表達(dá)LRP16后，對(duì)ERK1/2、p38、JNK蛋白表達(dá)的影響。

6、>　　(4).LRP16對(duì)LPS誘導(dǎo)下3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響
　　a.MTT法繪制細(xì)胞增殖曲線；
　　b.Westernblot檢測(cè)過表達(dá)或抑制LRP16后Akt蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：
　　(1).建立抑制或過表達(dá)LRP16基因的3T3-L1穩(wěn)定細(xì)胞系
　　a.用SuperFect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別把質(zhì)粒pcDNA3.1-LRP16和空白質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)入3T3-L1細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定

7、過表達(dá)LRP16的細(xì)胞株。采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)LRP16蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LRP16基因細(xì)胞系（3T3-L1-16）的LRP16蛋白含量約是對(duì)照組細(xì)胞系（3T3-L1-3.1）目的蛋白含量的2.37倍(p<0.05)。
　　b.構(gòu)建針對(duì)LRP16基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，該病毒轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞后Blasticidin篩3周。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示慢病毒轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%-90%，Wes

8、ternblot檢測(cè)顯示抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞系（3T3-L1-374）的LRP16蛋白減少至對(duì)照組細(xì)胞系（3T3-L1-GFPi）的40.6%(p<0.01)。
　　(2).LRP16對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞LPS/TLR4信號(hào)通路的影響
　　a.LPS可影響LRP16的蛋白表達(dá)水平：LRP16蛋白表達(dá)在LPS刺激后4h未發(fā)生明顯變化，8h、12h均呈劑量依賴性增高，24h蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低。
　　b.RT-PC

9、R結(jié)果顯示：抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6mRNA的表達(dá)水平，相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi分別減少至58%、62.4%、60%和56%(P<0.05)。WesternBlot結(jié)果顯示：抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374中TLR4和MyD88蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi分別減少至58.1%和60%(P<0.05)，IRAK-1和TRAF6蛋白表達(dá)減

10、少至50%和42%，顯著低于對(duì)照細(xì)胞(P<0.01)。
　　c.WesternBlot結(jié)果顯示：無LPS刺激，抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374中TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6的蛋白表達(dá)較對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi無明顯變化(p＞0.05)。
　　d.抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374中NF-κB核蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi減少至61%(P<0.05)。
　　e.培

11、養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6的蛋白含量減少至對(duì)照細(xì)胞的65%和68%(P<0.05)。
　　(3).LRP16對(duì)LPS誘導(dǎo)下MAPK信號(hào)通路的影響
　　WesternBlot結(jié)果顯示：過表達(dá)LRP16細(xì)胞3T3-L1-16的p-ERK1/2、p-p38和p-JNK較對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-3.1明顯增加(p＜0.01)；而抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374的p-ERK1/2、p-p38和p-JNK，較對(duì)照細(xì)胞3T3-L

12、1-GFPi明顯減少(p＜0.01)。
　　(4).LRP16對(duì)LPS誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞增殖的影響
　　a.MTT結(jié)果顯示：過表達(dá)LRP16前脂肪細(xì)胞增殖較對(duì)照組明顯減緩。
　　b.WesternBlot結(jié)果顯示：抑制LRP16表達(dá)細(xì)胞3T3-L1-374的p-serine-473Akt明顯較對(duì)照細(xì)胞3T3-L1-GFPi增多；過表達(dá)LRP16細(xì)胞3T3-L1-16的p-serine-473Akt，明顯較對(duì)照細(xì)胞3T3-L

13、1-3.1減少。
　　結(jié)論：
　　(1).成功構(gòu)建了過表達(dá)LRP16細(xì)胞系、抑制表達(dá)LRP16細(xì)胞系及對(duì)照細(xì)胞系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了穩(wěn)定的細(xì)胞模型。
　　(2).抑制LRP16基因可阻斷LPS/TLR4信號(hào)通路的激活，下調(diào)TLR4、MyD88、IRAK-1和TRAF6的表達(dá)，這可能是其對(duì)TLR4信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控機(jī)制之一；且LRP16可能通過下調(diào)TLR4信號(hào)通路，抑制NF-κB通路活性，減少通路下游炎癥因子TNF-α