LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的相關(guān)性研究及LRP16單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、LRP16基因是1999年從正常成人外周血淋巴細(xì)胞中克隆獲得的。LRP16基因定位于染色體11q11.2，是一雌激素(E2)反應(yīng)性基因，它在多種雌激素依賴(lài)性腫瘤中高表達(dá)。 在既往的研究中發(fā)現(xiàn)LRP16過(guò)表達(dá)不僅能促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，而且促進(jìn)細(xì)胞的侵襲生長(zhǎng)，并研究中證實(shí)LRP16基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)以及細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)了G1/S期的轉(zhuǎn)換；抑制LRP16可降低MCF-7細(xì)胞的侵襲生長(zhǎng)能

2、力，其機(jī)制涉及E-鈣黏著素(E-cadherin)基因的變化。對(duì)LRP16分子的活性研究也發(fā)現(xiàn)，LRP16是ERα的一個(gè)共激活因子，該作用方式不依賴(lài)于E2的存在，但E2可增強(qiáng)二者的作用。因此，我們認(rèn)為，LRP16在ERα陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生與進(jìn)展中應(yīng)有重要作用，抗LRP16的治療可能有利于ERα陽(yáng)性乳腺癌的好轉(zhuǎn)。 因子宮內(nèi)膜樣腺癌與乳腺癌同屬于激素相關(guān)性腫瘤，且我們?cè)贗shikawa細(xì)胞中的研究也發(fā)現(xiàn)LRP16促進(jìn)細(xì)胞的侵襲生長(zhǎng)，分

3、子水平的研究也涉及E-Cadherin基因的變化。因此本實(shí)驗(yàn)的第一部分通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜樣腺癌的臨床病例標(biāo)本進(jìn)行分析，在蛋白水平上進(jìn)一步闡明LRP16與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。 隨著對(duì)LRP16基因研究的不斷深入，我們?cè)絹?lái)越發(fā)現(xiàn)它在激素相關(guān)性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中有重要的作用，因此制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的單克隆抗體是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)的第二部分就是LRP16單克隆抗體的制備。LRP16McAb有利于對(duì)LRP16的組織分布和功能的進(jìn)一步研

4、究，也為腫瘤疫苗的研制和臨床研究創(chuàng)造條件。 第一部分、LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的相關(guān)性研究 目的：探討LRP16在子宮內(nèi)膜樣腺癌(EEC)中的表達(dá)及與臨床病理的相關(guān)性。 方法：用免疫組化法檢測(cè)76例EEC患者癌組織標(biāo)本中LRP16和雌激素受體α(ERα)、孕激素、E-Cadherin的表達(dá)水平。 結(jié)果：LRP16核陽(yáng)性率為67.11％(51/76)，LRP16漿陽(yáng)性率為96.05％(73/76)，漿核

5、均陽(yáng)性占64.47％(49/76)；ERα陽(yáng)性占51.32％(39/76)，陰性占48.68(37/76)．ERα陰性患者中LRP16核陽(yáng)性率(86.49％，32/37)明顯高于ERα陽(yáng)性患者(48.71％，19/39)(P＜0.01)，LRP16在胞核中表達(dá)與EEC患者的手術(shù)病理分期無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)，但組織學(xué)分級(jí)和E-Cadherin的表達(dá)呈相關(guān)(P＜0.05)。胞漿中分布的LRP16與ERα表達(dá)無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但胞

6、漿中的LRP16與EEC的手術(shù)病理分期呈明顯的負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，與PR的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，與組織學(xué)分級(jí)則無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。在LRP16核漿均陽(yáng)性的病例中，ERα陰性患者(81.08％，30/37)的比例明顯高于ERα陽(yáng)性患者(48.72％，19/39)(P＜0.01)；且LRP16在核漿中均有表達(dá)與EEC患者的手術(shù)病理分期及組織學(xué)分級(jí)無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。在EEC腫瘤細(xì)胞中核、漿分布的LRP16著色

7、強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。 結(jié)論：LRPl6在EEC細(xì)胞中均有表達(dá)，但其亞細(xì)胞分布與ERa狀態(tài)密切相關(guān)，LRP16在胞漿中的表達(dá)可能提示良好預(yù)后。胞核中的LRP16表達(dá)與腫瘤的侵襲性相關(guān)。胞核、胞漿的亞細(xì)胞定位改變可能提示腫瘤的惡性演進(jìn)。因此，本文認(rèn)為L(zhǎng)RP16基因可能EEC中是一重要的監(jiān)測(cè)因子。 第二部分、LRP16單克隆抗體的制備及應(yīng)用 目的：研制LRP16單克隆抗體。 方法：采用LRP16抗原免

8、疫小鼠，用免疫的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)PEG4000融合，以HAT和HT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，間接ELISA法篩選陽(yáng)性孔和有限稀釋法克隆細(xì)胞后，接種小鼠腹腔制備腹水抗體，抗體純化采用以SPA-Sepharose-6BFF為固定相的親和層析法，Westernblot、免疫組化和間接ELISA法鑒定抗體的特異性、Ig亞型和效價(jià)。 結(jié)果：獲得一株穩(wěn)定分泌抗LRP16單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，染色體眾數(shù)為95，其腹水抗體和純化的抗體效