APEC毒力島基因irp2、Fyua缺失對(duì)其毒力影響的研究.pdf

1、禽致病性大腸桿菌?。ˋvian Pathogenic Escherichiacoli, APEC）是引起禽類高死亡率的重要傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重危害。而耶爾森菌強(qiáng)毒力島(high pathogenicity island, HPI)是決定包括APEC在內(nèi)的多種腸道致病菌毒力和致病性的一個(gè)較大的染色體片段。有研究表明，irp2和fyua基因與鐵的攝取有關(guān)，是HPI的核心結(jié)構(gòu)和功能基因，但是有關(guān)其與APEC毒力之間的關(guān)系并未見(jiàn)

2、詳細(xì)報(bào)道。
　　本研究從HPI的主要結(jié)構(gòu)基因irp2、fyua入手，分別構(gòu)建了禽致病性大腸桿菌irp2和irp2/fyua基因缺失株，并研究基因缺失對(duì)其毒力因子轉(zhuǎn)錄水平、黏附DF-1細(xì)胞能力、半數(shù)致死量以及感染雛雞病理變化的影響，進(jìn)而揭示了irp2、fyua基因與APEC毒力之間的關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)一步明確HPI對(duì)APEC毒力的影響奠定一些基礎(chǔ)。具體的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、禽致病性大腸桿菌irp2和irp2/fyua缺失

3、株的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)利用Red同源重組技術(shù)對(duì)目的基因irp2、fyua進(jìn)行了分步缺失。首先將irp2基因的同源臂克隆至零背景克隆載體，然后將pKD3質(zhì)粒上的氯霉素抗性片段克隆插入到零背景載體中，形成用于Red同源重組的打靶序列。利用Red同源重組原理30℃表達(dá)出誘導(dǎo)蛋白，將該打靶序列的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至目的菌中，從而實(shí)現(xiàn)基因的互換。利用氯霉素的抗性標(biāo)記篩選出重組成功的菌株，并將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至陽(yáng)性菌株用于氯霉素抗性的消除，這樣

4、就成功獲得irp2單基因缺失株。以irp2單基因缺失株為出發(fā)株，利用同上的方法，進(jìn)行fyua基因的缺失，成功獲得irp2/fyua雙基因缺失株。
　　2、禽致病性大腸桿菌irp2缺失對(duì)其毒力的影響
　　本實(shí)驗(yàn)分別從RT-PCR法檢測(cè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、對(duì)DF-1細(xì)胞黏附力的比較、LD50的測(cè)定、感染動(dòng)物病理組織切片的觀察等方面探索了HPI毒力島 irp2的缺失對(duì)禽致病性大腸桿菌毒力的影響。Real-time

5、PCR結(jié)果顯示，與野生株相比，irp2缺失株的luxS，iss,ompA和 fimC等4個(gè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著下降（P＜0.01）。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定顯示，irp2的缺失對(duì)禽致病性大腸桿菌在LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)不會(huì)造成影響。對(duì)雞胚層纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞的黏附結(jié)果顯示，irp2的缺失使APEC的黏附能力下降為野生株的66.0％。羅曼雛雞的半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果顯示，irp2的缺失使APEC的毒力下降了34倍。心臟和肝臟的病理組織切片顯

6、示，野生株攻毒后，羅曼雛雞的心包膜附近出現(xiàn)了大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟周圍附近有炎性細(xì)胞聚集。而irp2缺失株攻毒后所引起的雛雞病理變化明顯減輕。
　　3、禽致病性大腸桿菌irp2/fyua缺失對(duì)其毒力的影響
　　本實(shí)驗(yàn)分別從RT-PCR法檢測(cè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定、對(duì)DF-1細(xì)胞黏附力的比較、LD50的測(cè)定、感染動(dòng)物病理組織切片的觀察等方面探索了HPI毒力島irp2/fyua的缺失對(duì)禽致病性大腸桿菌毒力的影響。R

7、eal-time PCR結(jié)果顯示，與野生株相比，irp2/fyua缺失株的luxS,pfs,tsh,iss,ompA和fimC等6個(gè)毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平極顯著的下降（P＜0.01）。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定顯示，irp2/fyua的缺失對(duì)禽大腸桿菌在LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)不會(huì)造成影響。對(duì)雞胚層纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞的黏附結(jié)果顯示，irp2/fyua基因的缺失使APEC的黏附能力下降為野生株的53.5%。irp2/fyua缺失株和irp2缺失株相比

8、，黏附能力下降為后者的14.7倍。羅曼雛雞的半數(shù)致死量檢測(cè)結(jié)果顯示，irp2/fyua的缺失使APEC的毒力下降了500倍。羅曼雛雞心臟和肝臟的病理組織切片顯示，irp2/fyua缺失株攻毒后所造成的雛雞病理變化不明顯。
　　通過(guò)Red同源重組成功獲得APEC irp2和irp2/fyua缺失株，同時(shí)irp2和irp2/fyua缺失株的毒力研究結(jié)果表明，irp2和irp2/fyua的缺失會(huì)引起APEC一些毒力因子表達(dá)水平的下降、黏