透明質(zhì)酸寡糖逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的體外研究.pdf

1、腫瘤的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)一直是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因。MDR形成的機(jī)制很復(fù)雜，包含多種可能的作用途徑與方式，主要包括依賴ATP外排泵的過度表達(dá)、降低藥物吸收、解毒系統(tǒng)的激活或存活途徑的改變。目前，臨床上使用的多種逆轉(zhuǎn)藥物如維拉帕米、環(huán)孢霉素、三氟拉嗪等多因其嚴(yán)重的心、肝、腎毒性作用而使其臨床應(yīng)用受到限制。國內(nèi)外學(xué)者正積極尋找作用靶點(diǎn)多、高效、低毒、逆轉(zhuǎn)效果顯著的腫瘤逆轉(zhuǎn)劑。
　　 透明

2、質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)是由相同的二糖重復(fù)單元排列而形成的無支鏈的直鏈高聚物，HA的相對(duì)分子量(Mr)約為106107Da，具有獨(dú)特的粘彈性和生理功能，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有保濕、潤(rùn)滑、調(diào)節(jié)滲透壓等作用。HA可以保護(hù)正常的細(xì)胞免受細(xì)胞毒性的作用，但同時(shí)也可以促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖和MDR。HA經(jīng)過降解可以得到HA寡糖(oligosaccharidesofhyaluronicacid，o-HAs)，Mr在1×1

3、04以下，其性質(zhì)與普通HA大不相同，甚至具有完全相反的作用。研究表明，LMWHA和o-HAs具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、促進(jìn)傷口愈合等活性。在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面o-HAs和HA相比較具有明顯的差異性，o-HAs可以增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，抑制腫瘤MDR。本課題研究了酶解制備的單一聚合度的o-HAs，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR作用的潛在機(jī)制。
　　 1單一聚合度o-HAs制備
　　 優(yōu)化酶法降解HA的最適合反應(yīng)條

4、件為底物濃度為10g/L，酶濃度為1.5×106U/L，pH5.0，反應(yīng)溫度為50℃。采用Bio-gelP6和G-10進(jìn)行分離純化，并通過質(zhì)譜分析確定制備樣品為o-HA4、o-HA6、o-HA8三種寡糖。
　　 2o-HAs對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響
　　 以MTT法檢測(cè)ADR對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算耐藥倍數(shù)，人慢性髓性原白血病細(xì)胞耐藥株K562/A02耐藥倍數(shù)為98.90，人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/Adr耐藥倍數(shù)為16

5、6.03。同時(shí)以MTT法檢測(cè)o-HAs對(duì)K562/A02和MCF-7/Adr生長(zhǎng)活性的影響，確定了o-HAs對(duì)K562/A02及MCF-7/Adr細(xì)胞的無毒劑量，在濃度為200μg/mL時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率仍低于20％。MTT法檢測(cè)o-HAs與ADR聯(lián)合使用時(shí)對(duì)K562/A02細(xì)胞及MCF-7/Adr細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有所提高，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，對(duì)K562/A02細(xì)胞逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為3.2429

6、、31251和4.2807，對(duì)MCF-7/Adr細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5.6172、9.1195和8.9066。利用自熒光測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ADR的蓄積，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADR的蓄積提高的倍數(shù)為2.8、2.95和3.08，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)ADR的蓄積提高的倍數(shù)為2.13、2.23和2.32。利用自熒光測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積和外排，o-HA4、o-HA6和o

7、-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)的羅丹明123的蓄積提高的倍數(shù)為2.34、2.45和2.46，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積提高的倍數(shù)3.31、3.47和3.01，且同時(shí)可以抑制羅丹明123的外排。
　　 3o-HAs逆轉(zhuǎn)MDR的作用機(jī)制
　　 以熒光素-熒光素酶法分析K562/A02細(xì)胞及MCF-7/Adr細(xì)胞中的ATP含量，來考察o-HAs對(duì)P-gp能量依賴性的影響。o-HA4、o

8、-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)ATP含量的降低率分別為29.76％、30.06％和32.60％，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)ATP含量的降低率分別為48.08％、51.88％和51.07％。以無機(jī)磷釋放法來檢測(cè)o-HAs對(duì)P-gpATPase活性的影響，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)P-gpATPase提高的倍數(shù)為4.32、4.22和3.81，MCF-

9、7/Adr細(xì)胞內(nèi)P-gpATPase提高的倍數(shù)為2.93、2.86和2.87。以非放射性方法檢測(cè)o-HAs對(duì)K562/A02細(xì)胞及MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)PKC活性的影響，評(píng)價(jià)o-HAs對(duì)P-gp磷酸化水平的影響，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)PKC活性降低率為54.36％、54.17％和62.11％，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)PKC活性降低率為58.86％、57.71％和59.125％

10、。以Westernblot法觀察o-HAs對(duì)細(xì)胞PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑中PTEN蛋白和Akt蛋白表達(dá)的影響，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)量提高的倍數(shù)為4.31、6.31和5.01，Akt蛋白表達(dá)抑制率分別為45.38％、51.84％和61.325％，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)量提高的倍數(shù)為2.31、2.54和2.58，Akt蛋白表達(dá)抑制率分別為43

11、.28％、56.04％和54.35％。利用RT-PCR方法觀察o-HAs對(duì)K562/A02細(xì)胞及MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)MDR1mRNA的影響，o-HA4、o-HA6和o-HA8濃度在100μg/mL時(shí)，K562/A02細(xì)胞內(nèi)MDR1mRNA表達(dá)水平下降率為13.49％、24.6％和27.78％，MCF-7/Adr細(xì)胞內(nèi)MDR1mRNA表達(dá)水平下降率為22.23％、29.36％和33.78％。
　　 本研究取得的主要研究成果:<

12、br>　　 1.確定了o-HAs具有良好的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的活性，可以明顯增加ADR和Rh123的胞內(nèi)蓄積量，同時(shí)有效抑制Rh123外排。
　　 2.確定了o-HAs可不同程度的降低腫瘤細(xì)胞ATP水平，提高P-gpATPase活性，并對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)PKC活性有不同程度的抑制作用。
　　 3.初步確定了o-HAs可以通過提高PTEN蛋白表達(dá)水平，并抑制Akt蛋白和MDR1基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)