消癌解毒方逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在確定消癌解毒方對(duì)肺腺癌細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，尋找出消癌解毒方對(duì)多藥耐藥蛋白的影響，并從分子生物學(xué)水平探究消癌解毒方對(duì)化療藥物多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。
　　方法:
　　1.選擇肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞、肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，并以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面P-gp、MRP蛋白的表達(dá)率。
　　2.以MTT法測(cè)定消癌解毒方對(duì)A549/DDP細(xì)胞的劑量效應(yīng)曲線，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取合適

2、的消癌解毒方實(shí)驗(yàn)劑量。
　　3.實(shí)驗(yàn)分為三組:A549細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞組、A549/DDP細(xì)胞+消癌解毒方組。以順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇三種化療藥物分別作用于上述三組細(xì)胞，應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化，評(píng)價(jià)上述三種化療藥物對(duì)三組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并得出細(xì)胞的半數(shù)抑制率(IC50)，從而判斷化療藥物的敏感性，同時(shí)計(jì)算出消癌解毒方對(duì)肺腺癌耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
　　4.以流式細(xì)胞儀檢測(cè)消癌解毒方對(duì)A549/DD

3、P表面P-gp蛋白、MRP蛋白的表達(dá)率以及細(xì)胞內(nèi)羅丹明123（Rho123）濃度的影響。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞MDR1，MRP基因mRNA水平的變化。
　　6.統(tǒng)計(jì)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。多組樣本比較采用One-way ANOVA比較各組細(xì)胞的差異;如果方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)比較組間差異，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，P≤0.05認(rèn)

4、為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞均呈上皮樣單層排列，傳代周期為3-4天，兩種細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期存活率均＞95％，形態(tài)上A549/DDP細(xì)胞與其親本細(xì)胞存在差異，光鏡下可見(jiàn)耐藥細(xì)胞體積略增大，細(xì)胞變形，并且多核巨細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。A549細(xì)胞膜上P-gp蛋白的表達(dá)率為68.6％、MRP蛋白的表達(dá)率為69.0％; A549/DDP細(xì)胞膜上P-gp蛋白的表達(dá)率為74.3％，MRP蛋白的表達(dá)率為

5、82.6％。
　　2.對(duì)DDP、5-FU、Taxol這三種抗癌藥，A549/DDP細(xì)胞均顯示耐藥性，其IC50分別為81.30±3.88、199.1±17.91、10.49±1.64，而A549細(xì)胞相對(duì)敏感，IC50明顯下降(P=0.000)，分別為17.68±2.02、63.52±2.09、4.68±1.19。耐藥細(xì)胞A549/DDP較親本細(xì)胞A549對(duì)三種抗癌藥的耐藥倍數(shù)分別為4.60、3.13、2.24。經(jīng)10mg/ml的消

6、癌解毒方作用后耐藥細(xì)胞A549/DDP對(duì)各抗癌藥的敏感性增強(qiáng)，其IC50明顯下降(P≤0.001)，分別為34.55±1.01、73.03±12.0、4.61±0.31，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.35、2.72、2.27。
　　3.A549/DDP細(xì)胞經(jīng)消癌解毒方10mg/ml作用24h后，細(xì)胞表面的P-gp、MRP蛋白表達(dá)率較作用前下降，由74.3％下降至69.0％，MRP蛋白表達(dá)率由82.6％下降至76.5％。
　　4.在Rh

7、o123蓄積實(shí)驗(yàn)，A549細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光很強(qiáng)，表達(dá)率為56.5％，而A549/DDP細(xì)胞內(nèi)Rho123熒光很弱，表達(dá)率僅為9.6％，加消癌解毒方10mg/ml后，細(xì)胞內(nèi)熒光明顯增強(qiáng)，表達(dá)率為27.80％，提示消癌解毒方可明顯增加耐藥細(xì)胞對(duì)Rho123的蓄積。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，A549/DDP+10mg/ml消癌解毒方組MDR1基因的含量約為A549/DDP組的78.94％，逆轉(zhuǎn)率為21.06％; A54

8、9/DDP+10mg/ml消癌解毒方組MRP基因的含量約為A549/DDP組的76.40％，逆轉(zhuǎn)率為20.60％。
　　結(jié)論:
　　1.消癌解毒方在體外可明顯提高肺腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性;
　　2.消癌解毒方在體外逆轉(zhuǎn)肺腺癌多藥耐藥的機(jī)制可能是通過(guò)減少M(fèi)DR1、MRP基因的表達(dá)，從而抑制跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，阻止細(xì)胞內(nèi)化療藥物的泵出，增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，增強(qiáng)對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷作用;
　　3.通過(guò)本實(shí)驗(yàn)證