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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是既往研究中常被忽視的一類基因,然而近來(lái)的研究結(jié)果證明lncRNA廣泛參與了各種生理和病理過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中也扮演關(guān)鍵角色,在非小細(xì)胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。
方法:
本研究首先通過(guò)lncRNA表達(dá)譜芯片,去核糖體RNA測(cè)序和公共數(shù)據(jù)平臺(tái)挖掘
2、注釋三種策略,全面系統(tǒng)地研究了NSCLC中的lncRNA表達(dá)圖譜,并發(fā)現(xiàn)大量在NSCLC中存在差異表達(dá)的lncRNA;結(jié)合生物信息學(xué)分析和the CancerGenome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù),我們鑒定篩選出一個(gè)在NSCLC組織中顯著上調(diào)的lncRNA: FEZF1 antisense RNA1(FEZF1-AS1,以下簡(jiǎn)稱F1);在NSCLC組織樣本中驗(yàn)證了F1的臨床相關(guān)性,并通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究F1可能的生物學(xué)功能。染色質(zhì)免
3、疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)和熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于研究c-Myc對(duì)F1表達(dá)的調(diào)控。RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation,RIP)和ChIP研究F1對(duì)下游基因的調(diào)控機(jī)制。
結(jié)果:
通過(guò)qRT-PCR和組織原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中,F(xiàn)1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著正相關(guān);生存分析結(jié)果顯示高表達(dá)F1的患者預(yù)后較低表達(dá)者更差
4、。我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性干擾F1的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)并構(gòu)建了過(guò)表達(dá)F1的質(zhì)粒,體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾F1可以顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)凋亡;而過(guò)表達(dá)F1的結(jié)果則相反。通過(guò)裸鼠皮下荷瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型,我們發(fā)現(xiàn)敲減F11之后NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著受到抑制。
轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)F1上游存在c-Myc結(jié)合位點(diǎn)E-Box,ChIP和熒光素
5、酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)c-Myc可以結(jié)合在F1基因上游的E-Box區(qū)域促進(jìn)F1的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)c-Myc和F1的拯救實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)F1部分介導(dǎo)了c-Myc的生物學(xué)功能。在NSCLC細(xì)胞中敲減F1之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,尋找發(fā)生差異表達(dá)的基因,基因集富集分析發(fā)現(xiàn)多梳狀沉默復(fù)合物2(polycomb repressive complex2,PCR2)調(diào)控對(duì)基因集在差異表達(dá)基因中被顯著富集。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)F1可以與PRC2的關(guān)鍵亞基EZH2綁定,在敲減F
6、1之后,ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPRY2、KLF15、GLIPR1基因啟動(dòng)子區(qū)EZH22富集減少,而且組蛋白3賴氨酸27位點(diǎn)三甲基化水平也顯著下降。
結(jié)論:
本研究系統(tǒng)地研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA的表達(dá)圖譜,并鑒定出F1是肺癌增殖、轉(zhuǎn)移的重要基因,闡明了F1綁定EZH2抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)機(jī)制;本研究從lncRNA角度揭示了NSCLC增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為NSCLC診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供了新的理論依據(jù)和靶標(biāo)
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