長(zhǎng)非編碼RNA FEZF1-AS1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌惡性進(jìn)展的功能和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是既往研究中常被忽視的一類基因，然而近來(lái)的研究結(jié)果證明lncRNA廣泛參與了各種生理和病理過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中也扮演關(guān)鍵角色，在非小細(xì)胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)中也發(fā)揮著重要調(diào)控作用。
　　方法：
　　本研究首先通過(guò)lncRNA表達(dá)譜芯片，去核糖體RNA測(cè)序和公共數(shù)據(jù)平臺(tái)挖掘

2、注釋三種策略，全面系統(tǒng)地研究了NSCLC中的lncRNA表達(dá)圖譜，并發(fā)現(xiàn)大量在NSCLC中存在差異表達(dá)的lncRNA;結(jié)合生物信息學(xué)分析和the CancerGenome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)，我們鑒定篩選出一個(gè)在NSCLC組織中顯著上調(diào)的lncRNA: FEZF1 antisense RNA1(FEZF1-AS1，以下簡(jiǎn)稱F1);在NSCLC組織樣本中驗(yàn)證了F1的臨床相關(guān)性，并通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究F1可能的生物學(xué)功能。染色質(zhì)免

3、疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)和熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于研究c-Myc對(duì)F1表達(dá)的調(diào)控。RNA免疫共沉淀(RNAimmunoprecipitation，RIP)和ChIP研究F1對(duì)下游基因的調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)qRT-PCR和組織原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中，F(xiàn)1的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著正相關(guān);生存分析結(jié)果顯示高表達(dá)F1的患者預(yù)后較低表達(dá)者更差

4、。我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性干擾F1的小干擾RNA(small interferingRNA，siRNA)并構(gòu)建了過(guò)表達(dá)F1的質(zhì)粒，體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干擾F1可以顯著抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)凋亡;而過(guò)表達(dá)F1的結(jié)果則相反。通過(guò)裸鼠皮下荷瘤模型和尾靜脈轉(zhuǎn)移模型，我們發(fā)現(xiàn)敲減F11之后NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著受到抑制。
　　轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)F1上游存在c-Myc結(jié)合位點(diǎn)E-Box，ChIP和熒光素

5、酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)c-Myc可以結(jié)合在F1基因上游的E-Box區(qū)域促進(jìn)F1的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)c-Myc和F1的拯救實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)F1部分介導(dǎo)了c-Myc的生物學(xué)功能。在NSCLC細(xì)胞中敲減F1之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，尋找發(fā)生差異表達(dá)的基因，基因集富集分析發(fā)現(xiàn)多梳狀沉默復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PCR2)調(diào)控對(duì)基因集在差異表達(dá)基因中被顯著富集。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)F1可以與PRC2的關(guān)鍵亞基EZH2綁定，在敲減F

6、1之后，ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)SPRY2、KLF15、GLIPR1基因啟動(dòng)子區(qū)EZH22富集減少，而且組蛋白3賴氨酸27位點(diǎn)三甲基化水平也顯著下降。
　　結(jié)論：
　　本研究系統(tǒng)地研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA的表達(dá)圖譜，并鑒定出F1是肺癌增殖、轉(zhuǎn)移的重要基因，闡明了F1綁定EZH2抑制下游基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學(xué)機(jī)制;本研究從lncRNA角度揭示了NSCLC增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為NSCLC診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供了新的理論依據(jù)和靶標(biāo)