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文檔簡(jiǎn)介
1、研究目的:
胰腺癌是一種惡性程度很高的實(shí)體腫瘤,胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是其主要的病理類型。在胰腺癌細(xì)胞中??蓹z測(cè)到Kras基因第12密碼子的點(diǎn)突變KrasG12D或KrasG12V。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。同樣,野生型Kras等位基因的狀態(tài)也影響著細(xì)胞對(duì)激活的原癌基因的反應(yīng)狀態(tài)。雜合性缺失(Loss of heterozygosit
2、y,LOH)常在腫瘤抑癌基因中出現(xiàn),原癌基因中少有LOH被觀察到。目前我們和其他研究小組在PDAC轉(zhuǎn)基因小鼠和人類胰腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)KrasG12D-LOH,且伴有KrasG12D-LOH的腫瘤細(xì)胞更易于增殖和侵襲轉(zhuǎn)移,但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開(kāi)錯(cuò)綜復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,其中mTOR信號(hào)通路受在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及能量代謝等多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。此外,PDAC是高度惡性的乏血管腫瘤,為了模擬其在體內(nèi)的微環(huán)境,本實(shí)
3、驗(yàn)探究分別在常氧和缺氧培養(yǎng)條件下,伴有或不伴有LOH的KrasG12D對(duì)PDAC細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為以及能量代謝狀態(tài)的影響,并初步探討mTOR信號(hào)通路在其中的調(diào)控作用。
研究方法:
1.本實(shí)驗(yàn)所用399細(xì)胞株和897細(xì)胞株由慕尼黑工業(yè)大學(xué)胰腺癌研究中心饋贈(zèng)。399細(xì)胞株和897細(xì)胞株均來(lái)源于KrasG12D PDAC轉(zhuǎn)基因小鼠,399細(xì)胞株KrasG12D的等位基因是野生型Kras,但897細(xì)胞株的KrasG1
4、2D等位基因野生型Kras丟失,即發(fā)生雜合性缺失(KrasG12D-LOH)。上述細(xì)胞株分別在常氧(5%CO2、95%空氣)和缺氧(1%O2、5%CO2、94%N2)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用CCK-8法和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在不同培養(yǎng)條件下KrasG12D-LOH對(duì)PDAC細(xì)胞增殖活力的影響。
2.利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,KrasG12D-LOH對(duì)PDAC細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的
5、影響。
3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在不同培養(yǎng)條件下KrasG12D-LOH對(duì)PDAC細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡水平的影響。
4.應(yīng)用ATP含量檢測(cè)試劑盒和乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)在不同培養(yǎng)條件下各組細(xì)胞的ATP含量和乳酸生成量。
5.應(yīng)用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)在常氧和缺氧培養(yǎng)條件下,各組細(xì)胞內(nèi)mTOR上游信號(hào)通路相關(guān)分子如Akt、AMPK、REDD1、mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)情況。
研
6、究結(jié)果:
1.CCK-8法和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,897細(xì)胞株的增殖能力和克隆形成能力均強(qiáng)于399細(xì)胞株(P<0.05),提示在常氧和缺氧環(huán)境中,KrasG12D-LOH均能促進(jìn)PDAC細(xì)胞的增殖。
2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,897細(xì)胞株的遷移能力強(qiáng)于399細(xì)胞株。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,897細(xì)胞株穿過(guò)鋪有Matrigel的人
7、工基底膜到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)均高于399細(xì)胞株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下KrasG12D-LOH均可促進(jìn)PDAC細(xì)胞的侵襲。
3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在常氧和缺氧條件下KrasG12D-LOH均能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。但在不同氧環(huán)境中,兩種PDAC細(xì)胞的凋亡情況均無(wú)明顯差異。
4.分別在常氧及缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞24h,897細(xì)胞株內(nèi)的ATP濃度均高于399細(xì)胞株(P<0.05)
8、。缺氧培養(yǎng)24h后,897細(xì)胞株的乳酸生成量顯著高于399細(xì)胞株(P<0.05)。但常氧培養(yǎng)24h后,兩種細(xì)胞的乳酸生成量無(wú)明顯差異(P>0.05)。
5.QRT-PCR結(jié)果顯示,在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,897細(xì)胞株的Akt、AMPK、REDD1和mTOR的mRNA表達(dá)量均顯著高于399細(xì)胞株。Western blot結(jié)果表明,在常氧及缺氧培養(yǎng)條件下,KrasG12D-LOH上調(diào)Akt的磷酸化水平、REDD1的表達(dá)水平及mTO
9、R的磷酸化水平。此外,在常氧條件下KrasG12D-LOH上調(diào)細(xì)胞內(nèi)AMPK的磷酸化水平,但在缺氧條件下,兩種細(xì)胞株內(nèi)AMPK磷酸化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
研究結(jié)論:
1.在常氧及缺氧條件下,KrasG12D-LOH均可促進(jìn)PDAC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。
2.在常氧及缺氧條件下,KrasG12D-LOH均可增加PDAC細(xì)胞內(nèi)ATP的含量;在缺氧條件下,KrasG12D-LOH促
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