2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、骨骼是人類(lèi)最大的器官。骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,其生長(zhǎng)方式主要有兩種,即膜內(nèi)成骨與軟骨內(nèi)成骨。其中軟骨內(nèi)成骨是軀干骨,四肢長(zhǎng)骨,以及部分不規(guī)則短骨生長(zhǎng)的主要方式,膜內(nèi)成骨則是頂骨,額骨和鎖骨等骨骼的主要形成方式。軟骨內(nèi)成骨在胚胎發(fā)育過(guò)程及長(zhǎng)骨形成等方面發(fā)揮重要的作用,目前公認(rèn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast growth factor,F(xiàn)GF)信號(hào)通路在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
  成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家

2、族由22個(gè)成員組成,目前認(rèn)為FGF2是其中表達(dá)最廣泛的細(xì)胞因子。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)與細(xì)胞膜上的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(Fibroblast growth factor receptor,F(xiàn)GFR)激活下游多種通路,產(chǎn)生一系列效應(yīng)。在小鼠模型及人類(lèi)病例中,F(xiàn)GFR點(diǎn)突變能引起多種類(lèi)型的侏儒。在軟骨細(xì)胞中,F(xiàn)GF信號(hào)通路能抑制細(xì)胞增殖。目前關(guān)于FGF信號(hào)通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究,但在軟骨組織中FGF信號(hào)通路是否通過(guò)影響非編碼

3、蛋白R(shí)NA從而發(fā)揮其對(duì)軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用,尚沒(méi)有得到很好的研究。
  近年來(lái)對(duì)非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)在胚胎發(fā)育,正常生理過(guò)程及疾病過(guò)程中的作用認(rèn)識(shí)日益加深。非編碼RNA不編碼成蛋白質(zhì),以其它方式發(fā)揮作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs)是指轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)堿基對(duì)的ncRNA,在物種間保守性不高,通過(guò)多種途徑調(diào)控基因的表達(dá)。Malat1是一個(gè)在哺乳動(dòng)物中高度保守存在

4、的LncRNA,最初在關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的篩選性研究中被發(fā)現(xiàn)。之后發(fā)現(xiàn)幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中Malat1均有高表達(dá),大量腫瘤學(xué)研究表明Malat1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有促侵襲和促轉(zhuǎn)移作用。Malat1在成骨細(xì)胞增殖,骨肉瘤增殖侵襲等方面具有促進(jìn)作用,這些研究表明在骨骼中,Malat1可能發(fā)揮一定的作用,但其在軟骨細(xì)胞中有無(wú)作用尚不清楚,在軟骨發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用的FGF信號(hào)是否與Malat1有聯(lián)系目前也不清楚。
  目的:
  本

5、實(shí)驗(yàn)室在FGF信號(hào)通路對(duì)軟骨的調(diào)控方面做了很多研究,積累了良好的基礎(chǔ)。關(guān)于FGF信號(hào)通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究,但在軟骨組織中FGF信號(hào)通路是否通過(guò)影響非蛋白類(lèi)分子,比如LncRNAs,從而發(fā)揮其對(duì)軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用,尚不十分清楚。
  因此我們首先以小鼠原代軟骨細(xì)胞,小鼠軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5,人類(lèi)正常軟骨細(xì)胞C28I2作為細(xì)胞模型,檢測(cè)了Malat1在軟骨細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)水平,我們的結(jié)果表明Malat1在小鼠和人的

6、軟骨細(xì)胞中均呈現(xiàn)高豐度表達(dá),這樣高的基礎(chǔ)水平提示Malat1在軟骨細(xì)胞中可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。因此在本課題中,我們利用小片段干擾RNA技術(shù)干擾了Malat1的表達(dá)水平,初步研究Malat1對(duì)軟骨細(xì)胞的作用。為了探究FGF信號(hào)通路是否調(diào)控Malat1的表達(dá),我們進(jìn)一步利用重組FGF2結(jié)合相關(guān)通路阻斷劑處理小鼠原代軟骨細(xì)胞,小鼠及人類(lèi)軟骨細(xì)胞系模型,探討了FGF2信號(hào)通路是否可以通過(guò)調(diào)控Malat1的表達(dá)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖。
  

7、方法:
  1.Malat1在軟骨細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)水平
  1.1分離C57小鼠新生幼崽(日齡3~5日)原代軟骨,接種培養(yǎng)48h后提取RNA,利用qPCR檢測(cè)Malat1的表達(dá)水平。
  1.2培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3,小鼠軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5,人正常軟骨細(xì)胞系C28I2,以及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353,24h及48h后提取RNA并檢測(cè)Malat1的表達(dá)水平。
  2.Malat1對(duì)ATDC5軟骨細(xì)胞

8、系增殖的影響
  2.1設(shè)計(jì)數(shù)條針對(duì)小鼠Malat1基因的siRNA并通過(guò)熒光指示劑和qPCR篩選出最有效的siRNA。
  2.2將siRNA轉(zhuǎn)染至ATDC5細(xì)胞并通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)研究Malat1敲減對(duì)ATDC5細(xì)胞增殖速度的影響。
  3.FGF2對(duì)軟骨細(xì)胞中Malat1表達(dá)水平的影響
  3.1用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細(xì)胞,及ATDC5細(xì)胞,在處理后不同時(shí)間點(diǎn)提取RNA,qPCR測(cè)定Malat1的表達(dá)水

9、平,以未處理組作為對(duì)照組。
  3.2用ERK通路抑制劑U0126單獨(dú)或與FGF2共同處理ATDC5細(xì)胞,在處理后24h收取RNA,qPCR檢測(cè)Malat1的表達(dá)水平,以未處理組作為對(duì)照組。
  3.3從本科室保育的β-catenin小鼠中分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng),48h后收取細(xì)胞并提取RNA,qPCR檢測(cè)Malat1表達(dá)水平的變化,以未敲除組作為對(duì)照組。
  3.4從本科室保育的FGFR1Co12陽(yáng)性細(xì)胞特異性敲除小鼠

10、及FGFR3系統(tǒng)性敲除小鼠中分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng),48h后收取細(xì)胞并提取RNA,qPCR檢測(cè)Malat1表達(dá)水平的變化,以同窩未敲除幼崽作為對(duì)照組。
  3.5設(shè)計(jì)針對(duì)Fgfr1的siRNA,并構(gòu)建和制備Myc-Fgfr1質(zhì)粒,確認(rèn)其工作效率后將兩者轉(zhuǎn)入ATDC5細(xì)胞,24h后利用qPCR技術(shù)檢測(cè)Malat1表達(dá)水平的變化,以未處理組作為對(duì)照組。
  結(jié)果:
  1.Malat1在多種軟骨細(xì)胞系中的表達(dá)豐度。

11、  我們首先利用qPCR檢測(cè)了NIH3T3細(xì)胞中Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平,以其作為參照,結(jié)果提示Malat1在C57小鼠原代軟骨細(xì)胞,小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5,人正常軟骨細(xì)胞系C28I2及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353中均為高豐度基礎(chǔ)表達(dá)。在ATDC5細(xì)胞中,24h及48h時(shí)間點(diǎn)Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)明顯差異。
  2.敲減Malat1對(duì)ATDC5細(xì)胞的增殖速度的影響。
  用si-Malat1轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察共轉(zhuǎn)染的熒光

12、指示劑,結(jié)果提示si-Malat1已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)染到ATDC5細(xì)胞中;收取細(xì)胞RNA,利用qPCR檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Malat1的表達(dá)水平被成功干擾,干擾效率超過(guò)50%;si-Malat1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),以未處理組作為對(duì)照組,結(jié)果表明Malat1被干擾后,ATDC5細(xì)胞的增殖速度出現(xiàn)了明顯下降。
  3.FGF信號(hào)對(duì)Malat1的調(diào)控。
  用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細(xì)胞,小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5,人正常軟

13、骨細(xì)胞系C28I2及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353,24h后收取細(xì)胞提取RNA,進(jìn)行qPCR檢測(cè)。以未處理組作為對(duì)照組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述細(xì)胞中,F(xiàn)GF2處理均明顯抑制了Malat1的表達(dá)水平。在ATDC5細(xì)胞中進(jìn)行多濃度和多時(shí)間點(diǎn)FGF2處理,提取RNA后qPCR檢測(cè),結(jié)果提示FGF2對(duì)ATDC5細(xì)胞中Malat1的抑制作用無(wú)劑量依賴(lài)效應(yīng),在24h即已生效,持續(xù)時(shí)間可達(dá)24小時(shí)以上。
  利用本科室保育的β-catenin Co12陽(yáng)性

14、細(xì)胞特異性敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng),利用qPCR檢測(cè)Malat1的表達(dá)水平,以未敲除組作為對(duì)照組,發(fā)現(xiàn)Malat1的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化。
  利用ERK信號(hào)通路抑制劑U0126單獨(dú)處理或與FGF2共同處理ATDC5細(xì)胞,收取RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè),結(jié)果表明ATDC5細(xì)胞經(jīng)U0126處理后,Malat1的表達(dá)水平顯著提高,且FGF2與U0126共同處理時(shí),F(xiàn)GF2不能抑制Malat1的表達(dá)水平。提示FGF2對(duì)Malat1

15、的抑制可能是通過(guò)FGF受體激活下游ERK通路完成的。
  利用本科室保育的FGFR1條件性敲除小鼠及FGFR3敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng),利用qPCR檢測(cè)Malat1的表達(dá)水平,以未敲除組作為對(duì)照組,發(fā)現(xiàn)在FGFR3敲除小鼠原代軟骨中,Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化,同時(shí),F(xiàn)gfr3敲除的小鼠幼仔原代軟骨經(jīng)FGF2處理后,Malat1的表達(dá)仍然是下調(diào)的;在FGFR1條件性敲除小鼠的原代軟骨中,Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)

16、水平顯著上升,并且在條件性敲除Fgfr1的小鼠原代軟骨中,與對(duì)照組相比,F(xiàn)GF2處理不能再抑制Malat1的表達(dá)。與此同時(shí),我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)Fgfr1的siRNA,并構(gòu)建制備了Myc-Fgfr1質(zhì)粒,將siRNA及Fgfr1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入ATDC5細(xì)胞中,24h后收取RNA進(jìn)行qPCR檢測(cè),結(jié)果提示Fgfr1表達(dá)水平被干擾后,Malat1的表達(dá)水平明顯增高,同時(shí),與FGF2處理的空白對(duì)照組相比,F(xiàn)gfr1被干擾后FGF2不能有效地抑制Mal

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