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1、目的:探討經(jīng)內(nèi)毒素(LPS)刺激不同時(shí)間及不同濃度谷氨酰胺(Gln)預(yù)處理后對(duì)人單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響。
方法:取健康志愿者新鮮外周血濾過的血盤,用生理鹽水按1∶1稀釋血液,用Ficoll-泛影鈉(Ficoll-Hypaque)密度梯度離心法提取出PBMC。得到的細(xì)胞置入含4ml培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,每瓶數(shù)量約為1×107個(gè)/ml。所有細(xì)胞均在37℃含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共分
2、為三個(gè)部分,第一部分將10mg/L LPS加入培養(yǎng)液中刺激PBMC不同時(shí)間(0、2、4、12、24h),留取細(xì)胞和培養(yǎng)液上清,采用western blot方法檢測(cè)HSP70的表達(dá);第二部分將不同濃度Gln(0、1、4、8、10和15 mmol/L)加入培養(yǎng)液中,分別處理2h后,加入內(nèi)毒素10 mg/ml刺激2h,留取細(xì)胞和培養(yǎng)液上清,采用western blot方法檢測(cè)HSP70的表達(dá);第三部分以LPS刺激PBMC2h后,使用10 mm
3、ol/L Gln分別刺激PBMC0.5h、1h、2h、3h后,提取蛋白,留取細(xì)胞和培養(yǎng)液上清,用Western blot檢測(cè)HSP70表達(dá)的變化。
結(jié)果:LPS刺激后,HSP70表達(dá)降低,在刺激2h后表達(dá)最低(P<0.05)。Gln能顯著增加HSP70的表達(dá),當(dāng)Gln濃度為10mmol/L時(shí),HSP70的表達(dá)量最高(P<0.05)。使用Gln刺激PBMC1h后,HSP70的表達(dá)最高(P<0.05),而后表達(dá)減少。
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